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2 févr. 2012 ... Objectif du cours: Apprendre a réfléchir sur des notions expérimental. Apprendre comment on ... Cours 1 - Lignées cellulaire - Culture cellulaire.

Biocell C. Alcaide 16/01/2012

Objectif du cours: Apprendre a réfléchir sur des notions expérimental Apprendre comment on réfléchit a un problème, comment on analyse des données Se mettre dans le bain de ce qu'est vraiment la recherche Comment interpréter une manipulation, qu'est ce qu'une interprétation car souvent on pense qu'il y a des solutions mais souvent au laboratoire il n'y a pas de solutions mais des interprétations, des hypothèses et on essaie de comprendre tout ça de façon séquentielle A travers les cellules souches tumorales, on va montrer que dans un sujet tout dépend de l'interprétation que l'on a du sujet. Sur le même papier on peut avoir des interprétations totalement opposées.



Cours 1 - Lignées cellulaire - Culture cellulaire

Classiquement on a trois grands types majeurs de lignées cellulaire: les lignées primaires, les cellules "immortalisées" et les cellules tumorales Cependant aucun outil n'est parfait, il y a toujours des avantages et des inconvénients. A chaque fois on va citer les avantages et inconvénients de chaque type de cellules.



1) Les lignées primaires

C'est la lignée directement issue d'un tissu (sang, biopsie de peau, voire des biopsie d'organe). C'est de plus en plus difficile d'obtenir des biopsies, il faut des accords avec différents organismes d'un point de vue éthique, des accords des médecins... Avant les chercheurs se prélevait directement eux même leur sang tandis qu'aujourd'hui cela peut prendre des mois pour avoir le moindre prélèvement de sang. N'empêche qu'on fait tout ça car d'un point de vue éthique c'est pas plus mal, quand on travaille sur des maladies génétiques et qu'on découvre qu'on a des polymorphismes dans son sang c'est pas toujours bon a savoir, il vaut mieux que le sang provienne de personnes anonymes.

• Avantage : Proche de la "réalité" de la vie d'une cellule Les lignées primaires présentent un grand avantage puisque c'est ce qui est le plus proche de la réalité. C'est pour ça que malgré que ce soit pénible d'en obtenir, on va essayer d'avoir accès a ce type de cellule. • Inconvénients : Matériel en faible quantité Mélange de différents types cellulaires Ces cellules ne peuvent être maintenues en culture (voire amplifiées) au mieux que pendant quelques générations. Evidemment le gros soucis c'est qu'on est sur du prélèvement de tissu donc on va avoir plein de types cellulaires qui sont mélangés et il va falloir séparer tout ça (voir tri cellulaire) et on a du matériel en très faible quantité donc il faut absolument avoir planifier le travail et tout avoir en miniaturisation pour surtout ne pas perdre de matériel et optimiser le matériel. La plupart du temps, on effectue un tri cellulaire et on utilise des propriétés des cellules qui sont toutes bêtes. Quand on travaille sur de la peau par exemple, cela va être relativement facile de différencier les mélanocytes et les keratinocytes.













Les keratinocytes se multiplient énormément donc a partir du moment ou on met de la peau sur une boite de culture, ce sont les keratinocytes qui se développent et le reste finit par être dilué, perdu... On a donc simplement autant de keratinocytes que l'on veut. Pour les mélanocytes on se sert de leur propriété intrinsèque. Ils sont très résistants a l'apoptose car ce sont des cellules qui produisent de la mélanine et qui forment la dernière couche de la peau qui est irradiée... Donc on met un peu d'agent toxique qui induit l'apoptose a faible dose, tout va mourir et ne restera en vie que les mélanocytes. On peut jouer sur des choses extrêmement simples pour séparer les cellules de différents tissus.











Pour le sang il y a aussi des choses très simples, on fait un prélèvement de sang qu'on fait passer sur un ficoll qui va tout simplement séparer le plasma, les globules rouges, et le buffy coat qui contient un mélange de tout les lymphocytes blancs (LymphocytesT, LymphocytesB, Monocyte/Macrophage, Neutrophiles). On peut les récupérer tout simplement en prélevant ces phases mais évidemment dans le buffy coat on ne peut pas faire de séparation, pour toutes ces cellules il faudra automatiquement passer par du tri cellulaire. Les monocytes/macrophages sont assez simples a récupérer car les monocytes sont les seules cellules adhérentes de le buffy coat donc les seules cellules qui adhèrent a la boite sont les monocytes et on les sépare directement comme ça même si généralement on les purifie quand même un petit peu après.

Les monocytes/macrophages sont légèrement adhérents et peuvent être séparés des autres cellules qui poussent en suspension. La séparation des autres cellules (lymphocytes B, T, neutrophiles, etc...) doit se faire par tri cellulaire (voir cours 3). Ces cellules là sont ce qu'il y a de plus proche de la réalité puisqu'on ne les a pas modifiées le gros soucis est le nombre de cellules et l'autre gros soucis est que ces cellules là ne peuvent être maintenues en culture pas plus de quelques générations car il y a un changement d'environnement en particulier pour des cellules qui étaient dans un tissu elles étaient en contact avec d'autres types de cellules qui leurs produisaient des facteurs de croissance, qui leurs envoyaient des signaux, elles avaient tout un environnement 3D, tout le contexte du tissu est perdu, même l'oxygénation, peut-être que quand on se met en culture on a pas la même quantité d'oxygène. Forcément quand on est en culture in vitro on ne reproduit pas l'exact micro-environnement de la cellule , ne serait-ce que la structure 3D du tissu est quelque chose de très important car les cellules quand elles sont en 2D ou en 3D elles vont se comporter de façon différente donc rien que ça fait qu'on peut altérer leur croissance.













Ces cellules sont des cellules tout à fait normales et donc a chaque division, elles vont aussi perdre des extrémités télomériques. A chaque division cellulaires, les télomères raccourcissent donc les cellules vont raccourcir leurs télomères et vont entrer dans une phase de latence ou elles ne vont plus trop se diviser puis au final elles vont finir par entrer en apoptose. Généralement ce sont les cellules souches qui expriment la télomérase mais ici se sont des cellules différenciées qui n'expriment plus la télomérase et donc elles ne réparent pas leurs extrémités télomériques. Donc ces cellules la entrent en sénescence au bout de quelques divisions selon les cellules c'est 10, 15, 20, 30 divisions mais a priori on ne dépasse pas ça tout simplement parce qu'elles entrent en sénescence. Donc quand on est in vitro tout ce qui est interactions avec les autres types cellulaires vont être perdues, donc si c'est des cellules qui s'entraident dans chaque tissu il y a des cellules qui vont produire des facteurs de croissance donc la on est hors interaction avec ces types cellulaires qui pourraient éventuellement. Le corollaire de ça c'est que dans le milieu de culture on essaie d'introduire des facteurs de croissance qui vont compenser ces manques d'interaction avec les autres cellules mais rien ne nous dit que la combinaison des facteurs de croissance qu'on a mit dans ce milieu la soit correcte. Maintenant il y a plein de gens qui bossent pour pouvoir créer des milieux synthétiques pour pouvoir apporter juste les facteurs de croissance qui sont nécessaires, par exemple on a

désormais des sérum spécifiques aux lymphocytes T, aux myélomes... On a des labos qui mettent en place un certain ombre de milieux spécifiques de chaque type cellulaire pour compenser le fait que les cellules sont isolées. On est aussi hors du contexte matriciel, c'est la cellule qui doit recréer la matrice qui ne sera peut-être pas parfaite car elle ne reçoit pas forcément les bons signaux au moins de survie si ce n'est de prolifération et donc du coup on risque d'altérer la croissance des cellules et puis surtout généralement on fait pousser les cellules en bidimensionnel, c'est à dire en adhésion sur un support et là le contexte tridimensionnel peut manquer à certaines cellules et peut altérer la capacité des cellules à se diviser, à se mouvoir... Le tridimensionnel peut aussi altérer la croissance.

Les cellules en culture sont : Hors interaction avec les autres types cellulaires Dans un milieu dont les facteurs de croissance ne sont pas forcément les bons Hors de leur contexte matriciel En monocouche au lieu d’un contexte 3D

Donc les cultures primaires sont ce qu'il y a de mieux par rapport au phénotype mais par contre au niveau de la quantité de cellules ça dérange beaucoup quand on veut imaginer faire un western blot ou il faut plusieurs millilitres de sang pour espérer faire un western blot donc c'est pas simple. Il y a une petite alternative qui est d'immortaliser les cellules.



2) Les cellules "immortalisées"

Ces lignées ne sont évidemment pas du tout immortelles mais on prolonge un petit peu leur vie, c'est tout ce qu'on est capable de faire. Cela n'existe que pour 2 types de cellules : Lymphocytes B et Fibroblastes Dans ces cellules là, on va les infecter avec des virus, pour les lymphocytes B on les infecte avec le virus EBV et pour les fibroblastes on les infecte avec le virus SV40 exclusivement.

• Pourquoi est-ce si limité? EBV (Epstein Barr Virus)possède un récepteur sur les lymphocytes B et ne peut infecter que les lymphocytes B et c'est la même chose pour SV40 (Simian Virus) qui n'a son récepteur que sur les fibroblastes. SV40 produit le large T antigen qui inhibe Rb et donc l’entrée en apoptose. Donc pour l'instant on ne sait immortaliser ces lignées là car on dispose de ces 2 virus mais ils sont tellement tropiques et ils ont une telle spécificité tissulaire qu'on ne sait faire marcher çà que sur ces 2 lignées. Les virus vont introduire des gènes qui vont permettre à la cellule de se diviser un petit peu plus et surtout de résister à l'apoptose. Le principe c'est que ces cellules ne sont évidemment pas immortelles mais simplement elles vont résister un tout petit peu mieux à la mort cellulaire et elles vont proliférer un tout petit peu plus rapidement que les autres cellules de culture primaires. Du coup on augmente le nombre de génération de ces cellules d'un facteur 3-4 ce qui est un gros avantage.

Attention : les cellules « immortalisées » ne sont pas immortelles, mais leur nombre de doublements est augmenté par rapport à une culture primaire Fibroblaste primaire : 10-12 générations Fibroblaste humain immortalisé : 30-40 générations

• Avantage : On dispose de plus de matériel Ces cellules sont peu différentes d’une culture primaire On a évidemment un petit peu plus de matériel cellulaire et c'est relativement peu différent qu'une culture primaire (par rapport aux lignées tumorales). • Inconvénient : Seuls deux types cellulaires sont disponibles sous cette forme On introduit des gènes à effet prolifératif et anti-apoptotique, modifiant donc ces activités cellulaires On ne sait faire ça réellement bien que sur 2 types cellulaires, les lymphocytes B et les fibroblastes ça qui limite le nombre d'analyses. Il existe des labos qui essayent de bidouiller des récepteurs ou des virus pour immortaliser d'autres types de cellules pour augmenter le panel qui pour l'instant est un peu limité. De plus si on bosse sur l'apoptose ou la prolifération cellulaire, les virus vont altérer profondément le comportement de ces cellules et évidemment ce ne sont pas des cellules de choix pour aller bosser sur l'apoptose ou la prolifération car le virus est en train de mettre un artefact majeur sur la capacité de la cellule a se diviser. Donc du coup ces cellules là sont bien utiles quand on bosse sur des patients, sur des défauts génétiques... mais si cette mutation affecte la prolifération ou l'apoptose on va avoir des gros biais par le virus donc il faut beaucoup s'en méfier. Cependant celles dont il faut le plus se méfier sont les cellules tumorales.



3) Les cellules tumorales

En labo, tout le monde s'en sert tranquillement sans même réfléchir que ce sont des cellules tumorales.

• Avantage : Ces cellules là permettent d'accéder quasiment a tout puisqu'il existe des cancers de quasiment tous les types de cellules. De plus les cellules vont se diviser de manière extrêmement rapide avec très peu d'apoptose et souvent les cellules réexpriment la télomérase ce qui va faire qu'elles ne sont plus sensibles à la sénescence, soit elles entrent en sénescence mais elles ne le sentent pas, soit elles limitent la sénescence. Du coup c'est des cellules qu'on peut garder X temps en culture. • Inconvénient : Les cellules tumorales ont souvent acquit beaucoup de mutations et sot donc extrêmement trompeuses sur le phénotype observé. Il faut donc toujours garder en tète que ce sont des cellules tumorales et du coup ce sont des lignées qui vont continuer à accumuler des mutations et il est évident qu'elles ne vont pas se comporter de manière normale.







Permet d’accéder à de nombreux types cellulaires (lymphomes T et B, carcinomes, gliomes, mélanomes, etc...). Ces cellules ont un haut taux de division cellulaire et peu d’apoptose (accumulation de mutations amenant à la cancérisation). Elles ré-expriment souvent la télomérase. Mais c’est une cellule qui contient de nombreuses mutations et qui peut donc être TROMPEUSE sur les phénotypes étudiés.

Cependant on utilise quand même ces lignées car une lignée tumorale se divise en 24h, une lignées immortalisées en 2-3 jours et une lignée primaire qui marche bien, qui est jeune, c'est une semaine puis toutes les 2 à 3 semaines. Quand on lit un papier, il faut donc toujours peser à vérifier sur quel type de lignée on travaille.

4) Stérilité

On travaille toujours sous des hottes à flux laminaire, l'intérêt est que c'est de l'air stérile qui circule donc déjà ça permet de nettoyer les bactéries, virus en suspension... pour ne pas contaminer les cellules mais aussi de protéger l'utilisateur. Il ne faut pas oublier que quand on travaille sur du sang ou sur des prélèvements de tissu, ça peut être contaminé par des virus, par plein de choses et il faut évidemment protéger l'utilisateur aussi. En général l'utilisateur est vacciné mais on est pas forcément vaccinés contre tout, en labo on est vacciné contre l'hépatite B, C mais il y a toujours le risque d'avoir le virus du SIDA... il faut donc une protection de l'utilisateur. Il existe 2 sortes de flacons de culture : - Boite de Petri : Ce sont des boites avec des couvercles qui s'ouvrent et permettent des manipulations rapides mais ce n'est pas ce qu'il y a de plus propre et stérile. On s'en sert quand de faire des manipulations rapides sur beaucoup d'échantillons. - Flacons : L'intérêt est qu'il y a un bouchon avec au bout un filtre qui permet de laisser entrer l'O2 et CO2 dans les cellules mais ne laisse pas passer les bactéries et du coup on peut laisser pousser les cellules tranquillement sans être contaminées par les fluides qui vont être sous la hotte.













Le milieu de culture est très riche et les bactéries, levure, champignons... adorent ce milieu et comme tout se divise 1000 fois plus vite que les cellules, le risque est de contaminer le milieu. On peut aussi introduire des antibiotiques dans le milieu pour empêcher les bactéries de pousser même si certains disent que ça peut abimer les cellules. Il n'empêche qu'il faut travailler de façon extrêmement précautionneuse. Dans le milieu de culture on met des acides aminés, des vitamines, du sucre comme source de carbone, de la glutamine comme source d'azote puis il faut aux cellules de l'O2 et du CO2... on introduit aussi un indicateur de pH qui est pratique pour montrer à quel moment le milieu est trop basique, cela veut dire qu'il manque du CO2 dans l'incubateur et au contraire si le milieu est trop acide cela signifie qu'il y a trop de cellules dans le milieu et que donc il faut vite s'en occuper car les cellules qui sont trop en train de se touchées et qui ont trop acidifié le milieu ça signifie qu'il manque des ressources en acides aminés... On rajoute du sérum decomplementé qui contient beaucoup de facteurs de croissance, généralement du sérum de veau foetale qui est très riche en facteurs de croissance mais on peut aussi prendre du sérum humain car il y a des cellules qui ne supportent pas le veau foetale mais c'est extrêmement couteux il existe toujours des risques de contaminations. Le sérum de veau foetal doit être testé car selon les lots de sérum certains vont être plus riches dans certains facteurs de croissance et il faut une combinaison de facteurs de croissance parfaite pour les cellules donc il faut choisir le sérum et voir dans quel lot les cellules survivent le mieux. Chaque lot de sérum peut avoir une petit différentiel dans les facteurs de croissance et les cellules peuvent souffrir de ce déficit en un facteur de croissance. Le sérum doit être décomplémenté car le complément est une association de protéases qui sont la pour faire des trous dans les bactéries, c'est la première ligne de défense. Le problème est que le complément ne s'associe pas qu'aux bactéries, il peut aussi s'associer aux cellules humaines quand elles sont hors contexte protégé. Le principe est donc de chauffer le sérum pour détruire le complément pour éviter qu'in vienne faire des trous dans les cellules aussi. On peut chauffer le sérum un tout petit peu à 56°C pendant une demi heure ce qui ne dénature pas les facteurs de croissance mais ça détruit le complément du coup les cellules poussent sans aucun soucis.





Quand on regarde au microscope c'est ce que l'on peut voir si les cellules vont bien ou si au contraire elles ne vont pas bien, elles sont pleines de vacuoles, elles sont toutes sombres on se dit que ces cellules on un petit soucis et on va commencer à vérifier tout ce qui ne va pas, elles peuvent être contaminées par des mycoplasmes qui sont de toutes petits bactéries qui poussent dans les cellules et qui les abiment beaucoup ou ça peut être un milieu pas bon avec un sérum mal décomplémenté, l'incubateur qui n'apporte pas assez de CO2.













La plupart des cellules sanguines, à part les monocytes/macrophages, poussent en suspension tandis que la plupart des autres vont être adhérentes sur le fond des boites. Du coup quand on veut les diluer, puisque les cellules se divisent en 24h il y a un moment ou la boite va être complètement remplie de cellules et les cellules auront utilisées tout le milieu, elles vont commencer à s'asphyxier, à être en manque de nutriment, il va donc falloir les diluer pour les distribuer dans plusieurs flacons, changer le milieu... On utilise de la trypsine pour faire le passage des cellules, ce qui revient a diluer les cellules. Le principe est très simple, les cellules sont adhérentes sur le fond de la boite car elles vont avoir synthétisé de la matrice extracellulaire et vont adhérer sur le plastique par l'intermédiaire de cette matrice extracellulaire. Le soucis c'est que quad elles adhèrent, elles adhèrent bien et on a beau y aller avec une pipette les cellules ne se décolleront pas, en fait elles vont exploser au passage de la pipette mais pour les décoller il faut vraiment un traitement très fort et il faut carrément une enzyme, c'est la trypsine qui va décaper la surface cellulaire de toutes ses protéines. Mais c'est une protéine donc elle est hydrophile et elle ne va donc pas passer à travers les membranes cellulaires qui elle sont hydrophobes donc du coup la trypsine ne digère que l'extérieur de la cellule, jamais l'intérieur et elle ne peut donc pas aller décaper l'intérieur et elle ne va pas faire exploser les cellules. L'intérêt de cette enzyme est qu'effectivement elle va grignoter toutes les protéines a la surface cellulaire et du coup elle va enlever toutes les jonctions entre les cellules et la matrice extracellulaire qui est sur le fond de plastique de la boite. Selon les cellules, c'est des choses qu'on doit faire tous les 2-3 jours, cette dilution doit être faite relativement fréquemment.



L'autre chose très pratique avec la plupart des cellules est qu'on peut congeler les cellules car on n'est pas la tout le temps et on a pas besoin tout le temps des cellules et en plus plus on va les laisser en culture plus elles vont s'abimer. Le principe est simple, on récupère les cellules après trypsine éventuellement, on enlève le milieu de culture après centrifugation et on resuspend le culot de cellules dans du sérum pour faire une milieu un peu riche et du DMSO qui va congeler mais sans faire de cristaux (ce qu'il faut éviter c'est qu'il y ait de l'eau car l'eau va donner des cristaux et du coup pourrait cisailler les cellules), on se place dans un milieu qui malgré la congélation va rester une petit peu visqueux et il n'y aura pas de cristaux, les cellules ne vont pas se cisailler par la congélation puis on congèle le tout selon divers protocoles dans de l'azote liquide. Les cellules peuvent alors rester dans l'azote liquide s'il n'y a pas d'aberration dans la présence d'azote liquide, mais si les cellules sont bien dans l'azote ça peut rester comme ça des années et quand on va décongeler 90% des cellules vont repousser si la congélation est relativement récente, si la congélation date de plusieurs années il peut y avoir 50% de cellules mortes mais n'empêche que ça va repousser. Pour la décongélation, on place les cellules à 37° très vite, on laisse même un petit bout de glaçon puis on met le contenu de l'ampoule dans du milieu de culture. Les cellules sont super simples à congeler et à décongeler, c'est vraiment des gestes extrêmement basiques, la seule difficulté est d'être rapide quand on congèle et on décongèle. C'est pour ça que les lignées sont si utilisées et utilisables car c'est relativement simple à travailler.

De plus en plus il y a des alternatives. On parle des lignées comme d'outils pratiques etc. mais il n'empêche que l'on se rend bien compte que les lignées permettent de décrypter des choses mais ce n'est pas parfait du tout. De plus en plus les gens développent des cultures en 3D, en particulier dans des gels de collagène, donc là les cellules ne vont plus pousser en 2D mais elles vont pousser carrément dans une gelée en tridimensionnel. c'est développé de plus en plus mais ça coute extrêmement cher et du coup on limite ça autant que faire se peut. Des qu'on le peut il faut passer à des cultures sur des prélèvements de tissus entiers parce que là évidemment il y aura un contexte normal de la cellule. On va commencer sur des lignées puis on revérifiera tout sur des tissus entiers. De plus en plus de labos travaillent sur des tissus reconstitués, ça se fait de façon relativement courante sur la peau. Des chercheurs ont réussit à reconstituer des peaux synthétiques en mélangeant des melanocytes, des kératinocytes, des fibroblastes... ce qui peut donner une sorte d'approche des interactions différentes des cellules au sein d'un tissu. Evidemment rien ne vaut le test final sur un modèle animal avec toujours une graduation dans les degrés de difficultés en allant de la levure à Caenorhabditis en passant par la drosophile, la souris... Il faut avoir un modèle vivant qui permet de valider les hypothèses de travail.