Cryopreservation of Phytophthora

Cryopreservation of Phytophthora                                                   1. Introduction Cryopreservation of Phytophthora cultures in a liquid nitrogen atmosphere,  at or close to –196 C, allows their long­term storage in a genetically stable  state. As with other organisms and biological tissues, the key features of this  technology are the use of controlled rate freezing to avoid ice crystal  formation within the tissues and immersion of the samples in a  cryoprotectant solution such as dimethyl sulfoxide (DMSO), glycerol or skim  milk/glycerol.   Major collections of this species, such as the World  Phytophthora Genetic Resource Collection (WPC, part of the World Oomycete  Genetic Resource Collection, WOC) at the University of California, Riverside   and ATCC, use this method.   2. Controlled Freezing Control of the rate of freezing is critical to optimize the ice nucleation  process and minimize cell injury.  Fast freezing results in intracellular ice  nucleation. This is lethal to the cell or tissue.  At very slow freezing rates cell  death is also excessive due the ‘pickling’ effects of long periods of exposure  to hypertonic solutions.  At optimal rates of freezing the exposure time to  hypertonic conditions is minimized while intracellular ice formation is  prevented. Finally, as most physical parameters which cells are exposed to  vary in a non­linear fashion with respect to temperature, ideally the freezing  process should take this into account. The basic process involves the following steps: i.

Equilibration of the sample with the cryoprotectant (see section 3  below) at room temperature to permit uptake of the solution

ii.

Cooling of the samples at ~ 1 to 2 C per min to 0 C, then 10 min at  O C, followed by ~1 C per min down to –10 C

iii.

Following thermal equilibration of the samples prior to ice crystal  growth, the temperature is then dropped further to ­44 C 

iv.

Finally, the samples are cooled very rapidly from ­44 C to – 120 C  in ~10 min

The frozen samples are then deposited under liquid nitrogen at –196 C.   Samples can be withdrawn from the cryogenic facility and brought  to room temperature by immersion in a water bath at 20 C, or  simply by placing them on a solid surface at room temperature.  They are then plated out, following removal of surplus cryogenic 

fluid using an absorbent surface such as  sterile paper towels, in or  on a suitable nutrient medium, either liquid or agar based.  Specific Protocol used at UCR  The following actual protocol (based on that originally devised by Hohl and  Iselin, 1987) is used with a programmable freezer at UC Riverside: i.

ambient (~24 C) to 0 C in 20 min

ii.

hold at 0 C for 10 min

iii.

0 C to –10 C in 6.3 min

iv.

immediately to –40 C 

v.

–40 C to –37 C in 0.3 min

vi.

hold for 1.5 min at –37 C

vii.

–37 C to –19 C in 3.4 min

viii.

–19 C to –44 C in 16 min

ix.

–44 C to –120 C in 10 min

x.

hold for 20 min at –120 C

xi.

transfer to liquid nitrogen at –196 C This protocol has been used at UCR since 1986 with consistently  good results.  

3. Cryoprotectants Cryoprotective additives suitable for Phytophthora include skim  milk/glycerol, dimethyl sulfoxide (dimethyl sulphoxide, DMSO), and 1,2­ propanediol.  Cell membranes are permeable to these compounds.  They  reduce damage following freezing and thawing, by increasing the unfrozen  fraction and thereby reduce the ionic composition of the tissues.  There can  be significant differences in the protective efficiency of different  cryoprotectants.  This may be the result of differing cellular toxicities and/or  permeability to specific compounds.  In our own experience at UCR we have  noticed no difference in recovery with either a skim­milk/glycerol mixture or  DMSO used as cryoprotectants. In limited trials using 15% 1,2­propanediol it  also gave good results.    

Skim milk/glycerol  Aqueous 20% glycerol and 17% Difco Bacto skim milk are autoclaved at 121  C for 10 min.  A 1:1 mixture of the two sterilized solutions is prepared. DMSO  A 15% aqueous solution of DMSO is autoclaved at 121 C for 15 min. Paul Tooley has provided a different protocol for DMSO:   Make up some 10% DMSO in the hood (DMSO is toxic) and filter sterilize into a sterile  test tube,  or beaker.  Pipette 1 ml of sterile 10% DMSO into screw­cap cryogenic  storage vials.  Label the vials with the isolate number and date.  Use 0.2­micron solvent­resistant membranes to filter­sterilize the DMSO.  We use  Teflon membranes in 25 mm disposable syringe filters made by Schleicher and Schuell  (Spartan­T membranes).   DMSO will melt ordinary membranes.  Alternatively, buy  presterilized DMSO (Sigma D­2650 vials, etc.) and dilute it to 10% using sterile water,  in sterile test tubes.  Keep at room temp covered with aluminum foil.

3­18­93, updated 3­12­01 Paul Tooley 4. Additional Factors Isolates are grown at their optimal temperatures (16 to 24 C) for 4 to 10 days  dependent on growth rate on a nutrient rich medium such as V8 juice or Rye seed  agar.  From the growing margins of these cultures, ~0.5 to 0.8 cm agar culture disks  are punched with a sterile cork borer. These are then placed in a cryo tube (such as  Nunc polypropylene tube with polyethylene cap, radiation sterilized).  Cryoprotectant is  added to cover the agar disks.  We place 5 agar disks in 1 ml of cryoprotectant in 2 ml  volume cryo tubes and add 1 ml of cryoprotectant solution. Additionally, the prepared cryotubes are routinely stored at 4 to 5 C for 1­2 days to  facilitate cold hardening.  This step is probably not necessary. It is very important to ensure that cultures are completely free from bacterial or other  microbial contaminants prior to cryopreservation. In our experience contaminated  cultures can be extremely difficult to ‘clean up’ following this procedure, particularly if  they are inherently very slow growing.  A simple method to test that the agar­grown  culture is bacteria­free is to incubate sample agar culture disks  in LB broth overnight.     

  5. References Dahmen, H., Th. Staub and F.J. Schwinn. 1983. Technique for the long­term  preservation of phytopathogenic fungi in liquid nitrogen. Phytopathology 73:  241­246. Hohl, H.R. and K. Iselin. 1987.  Liquid nitrogen preservation of zoosporic  fungi.  In  Zoosporic fungi in teaching and research. Pages 143­145. Edited  by M.S. Fuller and Alan Jaworski. Jong, S.C. and W.B. Atkins. 1985. Conservation, collection, and distribution  of cultures.  In  Fungi pathogenic for humans and animals. Vol. B, Part 2.  Edited by D.H. Howard. Smith, D. 1982.  Liquid nitrogen storage of fungi. Trans. Br. Mycol. Soc. 79:  415­421. Smith, D., G.E. Coulson and G.J. Morris. 1986. A comparative study of the  morphology and viability of hyphae of Penicillium expansum and  Phytophthora nicotianae during freezing and thawing. J. Gen. Microbiol. 132:  2013­2021. Tooley, P.W. 1988. Using uncontrolled freezing for liquid nitrogen storage of  Phytophthora species. Plant Dis. 72: 680­682.    Michael David Coffey  22 July 2008 (update 21 October 2010)