Disciplina de reproducţie obstetrică şi ginecologie Anul VI medicină ...

Disciplina de reproducţie obstetrică şi ginecologie Anul VI medicină veterinară CURSUL nr. 2 ÎNSĂMÂNłĂRILE ARTIFICIALE prima generaŃie de biotehnici de reproducŃie realizarea rapidă a progresului genetic la animale IA la bovine, ovine, caprine, suine, cabaline, canide, felide, păsări şi chiar insecte (Hafez, 1993) 1789 abatele Spallanzani, pui de câine avantaje: 1. realizarea progresului genetic; 2. controlul bolilor cu transmitere sexuală; 3. disponibilitatea evidenŃelor de reproducŃie riguroase, indispensabile unui bun management reproductiv; 4. randament şi implicit,profit economic. RECOLTAREA, EXAMENUL ŞI PRELUCRAREA SPERMEI ÎN VEDEREA CONSERVĂRII Managementul masculilor în vederea recoltării spermei • condiŃiile asigurate masculilor • alimentaŃia - carenŃe (pubertate întârziată; infertilitate) • alimentaŃia - excese (îngrăşare; caracteristici spermă) • dimensiunile testiculare - corelate cu potenŃialul producŃiei spermatice recoltarea spermei • saltul şi procedurile de stimulare • frecvenŃa recoltării spermei (taur, berbec, vier, armăsar, câine) • metode utilizate (vaginul artificial, electroejacularea, masajul transrectal) Examenul spermei evaluarea spermei şi fertilitatea - cel mai frecvent la tauri şi mai rar în cazul masculilor altor specii culoare, miros, vîscozitate, pH, precum şi concentraŃie, mobilitate, frecvenŃa anomaliilor Examenul spermei • Aspectul şi volumul spermei • ConcentraŃia spermatozoizilor • Morfologia spermatozoizilor • Anomalii moştenite ale spermatozoizilor • Mobilitatea spermatozoizilor • Aprecierea capacităŃii fecundante a spermatozoizilor

Nomenclatura parametrilor uzuali utilizaŃi în evaluarea spermei Parametrul volum

concentraŃie

mobilitate viabilitatea anomalii ale spermatozoizilor

Criteriul de evaluare absent redus crescut zero redus normal crescut scăzută toŃi spermatozoizii morŃi procent crescut

Nomenclatura aspermie hipospermie hiperspermie azoospermie oligozoopsermie normozoospermie polizoospermie astenozoospermie necrozoospermie teratozoospermie

“taur probabil fertil” • peste 500 milioane spermatozoizi per ml • mai mult de 50% spermatozoizi cu mişcări progresive de înaintare • peste 80% spermatozoizi cu morfologie normală Caracteristici comparative ale spermei de câine (Oettle, 1993)

Conservarea spermei • Crioconservarea (glicerolul - criomodificări) • Răspunsul celular la crioconservare şi crioprotectori (cristale de gheaŃă expunerea prelungită la săruri) • Caracterstici de specie ale susceptibilităŃii spermatozoizilor la crioalterări (stresul osmotic) Un bun diluant (Hafez, 1993): (a) să asigure nutrienŃi, drept sursă de energie; (b) asigurarea protecŃiei împotriva acŃiunii dăunătoare exercitate de răcirea rapidă; (c) să reprezinte un tampon capabil să prevină modificările nocive ale pH-ului, rezultate în urma generării acidului lactic; (d) menŃinerea presiunii osmotice şi a echilibrului electrolitic optime; (e) inhibarea dezvoltării bacteriilor; (f) sporirea volumului spermei, în aşa fel încât să poată fi utilizată pentru mai multe inseminări; (g) să protejeze celula spermatică pe parcursul procesului de congelare Depistarea estrului şi inseminarea femelelor 1. utilizarea unui metrial seminal de bună calitate; 2. respectarea tehnicii de decongelare precum şi a celei de depunere a spermei în tractul genital al femelei; 3. sănătatea deplină a aparatului genital femel;

4. inseminarea la momentul optim al estrului. Depistarea estrului şi inseminarea femelelor • depistarea estrului şi evidenŃierea momentului optim de inseminare factor limitativ • spermatozoizii să fie capacitaŃi şi să ajungă în apropierea ovocitei la scurt timp după ovulaŃie • detectarea ovulaŃiei este dificil de realizat, momentul inseminării trebuie să fie raportat la cel al debutului estrului Eficacitatea metodelor de detectare a estrului (Holman, 1987, cit. de Hafez, 1993) Metoda de detectare Taur încercător ObservaŃie vizuală

FrecvenŃa observaŃiilor vizuale de 2 ori / zi de 3∗ ori / zi de 2 ori / zi

% depistat

de 3∗ ori / zi

70 - 80

80 – 90 85 – 100 65 – 75

∗3 observaŃii a câte 20 minute : dimineaŃa devreme, după amiaza şi seara la ora 22

EficienŃa depistării estrului la vaci 3 depistări a câte 15 minute (la orele 8, 14 şi 21) – o eficienŃă a depistării de 69,6% 3 depistări a câte 30 minute (la orele 8, 14 şi 21) – o eficienŃă a depistării de 81,2% 4 depistări a câte 30 minute (la orele 8, 14, 21 şi 24)– o eficienŃă a depistării de 84,1% Perioada estrală • semne clinice • prezenŃa mucusului la comisura inferioară a vulvei • status hormonal specific (LH, estrogeni) • pregătirea ovulaŃiei (la aprox. 24 de ore după “vârful” de LH) • momentul optim de inseminare (10 ore după peak-ul de LH) controlul estrului Inducerea estrului la vaci de lapte care nu sunt observate în estru până la 45 de zile postpartum;

Sincronizarea unei grupe de viŃele pentru inseminarea cu spermă provenită de la tauri care asigură “fătare uşoară”; Reducerea timpului necesar pentru depistarea estrului; Facilitarea utilizării IA în mod extensiv; Sincronizarea vacilor donoare şi a celor receptoare pentru embriotransfer; Inducerea activităŃii ovariene la vacile de carne cu anestru de lactaŃie. manipularea creşterii valului folicular • inducerea sincronizată a dezvoltării unui nou val folicular la toate femelele tratate • rezultă dezvoltarea sincronă a unui folicul dominant • se asociază iniŃierea luteolizei fie la momentul emergenŃei valului folicular, fie imediat după selecŃia foliculului dominant • VA REZULTA un folicul dominant nou selectat la mai mult de 95% din femelele tratate sincronizarea ESTRULUI • sincronizarea LUTEOLIZEI • sincronizarea VALURILOR FOLICULARE Utilizarea PGF2alfa • regresia corpului luteal • dinamica valului folicular (momentul apariŃiei estrului) • fertilitatea la estrul indus se apropie de cea obŃinută la estrul spontan • debutul perioadelor estrale va fi răspândit pe parcursul a 2-5 zile de la adm. PGF • sunt necesare două administrări la 10-14 zile interval cu IA la estrul depistat • două adm. la 11 zile şi IA programată (72-96)

PGF2alfa - PROGRAMUL 1 PG 1

depistare estru şi inseminare

PG 2

0

11

IA dublă, programată

14 15

DistribuŃia prognozată a estrului: ziua I - 5%

ziua II - 20% ziua III - 45 %

ziua IV - 20% ziua V - 5% restul reacŃionează mai târziu sau deloc

PGF2alfa - PROGRAMUL 2 PG

depistare estru şi inseminare

0

5

6

IA dublă, programată

7 11

Pe parcursul a 10 zile este posibilă inseminarea aceluiaşi număr de femele, ca şi în cazul inseminării fără sincronizare pe parcursul a 21 zile. Dacă 20-25% din vaci intră în estru în primele cinci zile, atunci majoritatea efectivului ar trebui să fie cu activitate ciclică.


depistare estru şi inseminare 1

0

6


PG 2 depistare estru şi inseminare

0

IA dublă, programată depistare estru şi inseminare

6

9 10

Utilizarea progestagenelor • Tratamentele cu progestagene mimează faza luteală a ciclului. Pentru a obŃine un estru fertil normal, lungimea tratamentului cu progestagene a fost stabilită la 10 – 12 zile. • Progestagene sub formă de: soluŃie injectabilă, dispozitive vaginale, implant subcutan •

administrarea progestagenelor în combinaŃie cu estradiolul la debutul tratamentului nu numai că va regla parŃial durata de viaŃă a corpului luteal existent, ci şi va exercita un rol în influenŃarea valurilor foliculare ulterioare.

generat de CL

profilul progesteronului

generat de progestagene

estrogen progestagen Estru

9

11

13

15

17

0 2

4 6 8 10

generat de CL




0 2

liza CL

4 6 8 10

Estru

0 2

4 6 8 10

generat de CL




14 16 18

0 2

4 6 8 10

generat de CL



estrogen progestagen

liza CL

Estru

0

Estru

2 4 6 8 10 12

0 2

4 6 8 10

generat de CL



estrogen progestagen Estru 14 16 18

9

0 2 4 6 8 10 11 13 15 17 0 2 4 6 8 10 12

0 2

4 6 8 10

Depistarea estrului şi însămânŃarea artificială la oaie şi capră IA la ovine • cervixul - barieră anatomică • IA intrauterină extrem de dificilă (rata concepŃiei ajunge spre 75%, faŃă de 30% în cazul inseminării intravaginale) • posibilă laparoscopic • se justifică doar în cazul introducerii caracterelor valoroase în efectiv Sincronizarea ovinelor • sezon de reproducere • pesarii intravaginale cu progestagene (12-14 zile) şi PMSG la extragerea pesariilor (estrul apare la 48 de ore de la extragerea pesariilor) • 2 adm. de PGF2alfa la 11 zile (estrul apare la 24-48 de ore după ultima PGF) • pesariile cu progestagene generează rezultate superioare faŃă de PGF Momentul inseminării • IA se efectuează la 48-60 de ore consecutiv extragerii pesariilor sau la 72-96 de ore după administrarea PGF2alfa • o singură inseminare - 55 de ore după extragerea pesariilor • două inseminări - la 48 şi 60 de ore • sperma diluată îşi păstrează proprietăŃile timp de 24 de ore la 5°C • din ejaculat mediu rezultă 10-30 de doze, fiind necesare 200-500 milioane spermatozoizi (fcŃ. de locul depunerii) • decongelarea - la 35 °C, timp de 30 de secunde

Locul depunerii spermei • Intravaginal (60% G ptr. sperma proaspătă, 40% pentru cea congelată) necesare 500 milioane spermatozoizi • Intracervical - rezultate foarte bune, în special cu sperma congelată; profunzimea afectează rata gestaŃiei • Intrauterin ÎnsămânŃarea artificială la caprine • cervixul uşor de tunelizat • diestru mai lung - pesariile se menŃin 17 zile • monte la estrul exprimat (12 şi 24 de ore de la debutul estrului) - rata G de 60% • congelarea spermei - separarea lichidului seminal • contenŃie - anestezie generală ÎnsămânŃarea artificială la scroafă • Durata estrului şi momentul ovulaŃiei raportat la cel al debutului estrului sunt supuse unei puternice variabilităŃi la scroafă • Utilizarea examenului ecografic al ovarelor a permis stabilirea faptului că ovulaŃia se produce undeva la trei sferturi (72±15%) din durata integrală a estrului • Almeida şi col. (2000) - o durată medie a estrului de 52,6 ore (limitele fiind cuprinse între 30 şi 72 de ore), ovulaŃia producându-se între 30 şi 60 de ore (în medie la 44 de ore, adică la aproximativ 85% din durata perioadei estrale, raportat la debutul estrului) • sperma diluată - 4-7 zile la frigider (4-5 miliarde spermatozoizi per doză) • sincronizarea căldurilor - progestagen în furaje (Suisynchron) + PMSG • sincronizarea căldurilor - PG600 (gonadotropină serică 400UI şi gonadotropină corionică 200UI); PG600 induce şi poliovulaŃie (embriotransfer) • Rezultatele tratamentelor sunt afectate de momentul aplicării lor raportat la cel al înŃărcării purceilor, precum şi de prezenŃa sau absenŃa ciclicităŃii ovariene ÎnsămânŃarea artificială la iapă • material seminal proaspăt sau congelat • depistarea estrului - armăsar încercător • semne clinice de estru - obligatoriu ETR • De-a lungul perioadei de călduri, diametrul foliculului creşte cu aproximativ 3 mm/zi, până cu două zile înaintea producerii ovulaŃiei, când mărimea rămâne constantă. Cu aproximativ 12 ore înainte de ovulaŃie, dimensiunea foliculului descreşte cu 2-3 mm, acesta devine mai fluctuent, iar forma sa rotundă se transformă într-una triunghiulară neregulată, datorită descreşterii presiunii interioare. Stabilirea momentului ovulaŃiei se face prin examene transrectale repetate, precum şi prin ecografie. • Se urmăreşte efectuarea inseminării cât mai aproape de momentul ovulaŃiei, astfel încât să rezulte un indice de inseminare optim. • Dacă inseminarea are loc cu 24-12 ore înaintea producerii ovulaŃiei, rata gestaŃiei poate atinge 72%, iar în cazul efecutării inseminării în ultimele 12-6 ore premergătoare ovulaŃiei, rata instalării gestaŃiei poate ajunge la 100%. • În cazul inseminării cu material seminal congelat, este necesară repetarea examenului transrectal la interval de 8 ore, pentru a putea estima cu cât mai multă acurateŃe momentul ovulaŃiei

ÎnsămânŃarea artificială la căŃea Dispareunie vs. interes economic Incapacitatea masculului: • lipsa experienŃei • absenŃa libidoului • afecŃiuni genitale • afecŃiuni prostatice Femela refuză monta: • incapacitate fizică • probleme psihologice • moment inoportun (necorelat cu ovulaŃia şi nivelul hormonilor estrogeni)

Examen clinic

Frotiu vaginal

CĂłEAUA nu se pretează (este prea devreme sau prea târziu), sau sunt călduri anovulatorii.

CăŃeaua se pretează Recoltarea spermei

Spermă necorespunzătoare NU se inseminează

Dozare progesteron

Spermă de bună calitate

2 inseminări la 2 zile interval

ÎnsămânŃarea artificială la căŃea • determinarea momentului ovulaŃiei (frotiu vaginal, nivel progesteron, vaginoscopie) • recoltarea şi examenul spermei - caracteristicile ejaculatului şi capacitatea fecundantă a spermei • refrigerarea spermei la 4°C - câteva zile • inseminarea - profund intravaginal • sperma refrigerată - fecunditate de 85% • sperma congelată - 55% în cazul depunerii intravaginale şi 70% la depunerea intrauterină ÎnsămânŃarea artificială la pisică • controlul estrului cu PMSG, FSH sau HCG • momentul IA (două însămânŃări artificiale la interval de 24 de ore, precedate de fiecare dată de 50 UI de HCG) • sperma se depune în vaginul anterior sau cervixul posterior • nu este posibilă diluarea ejaculatelor

Disciplina de reproducţie obstetrică şi ginecologie Anul VI medicină veterinară

CURSUL nr. 3

ASPECTE FIZIOLOGICE ACTUALE ale vacii de lapte Intervalul până la prima ovulaŃie FuncŃionalitatea corpului luteal FuncŃionalitatea foliculilor ovarieni Exprimarea estrului Calitatea ovocitelor FuncŃionalitatea uterului CONTROLUL CICLULUI SEXUAL PRIN INTERMEDIUL MEDICAłIEI anestrul sincronizarea estrului şi depistarea estrului inseminarea programată sincronizarea reinseminărilor

Hormoni utilizaŃi în inducerea şi sincronizarea ovulaŃiei GONADOTROPINE PMSG - acŃiune similară FSH (stimulează maturarea foliculară) HCG - acŃiune similară LH; (induce ovulaŃia) asociere PMSG+HCG; (combină acŃiunea FSH şi a LH) GnRH - induce eliberarea LH şi FSH din hipofiza anterioară PROGESTAGENI Progesteron sau progestageni sintetici - implant, spirală sau burete intrevaginal (PRID = progesterone releasing intravaginal device) MIMEAZĂ ACłIUNEA (PREZENłA) CORPULUI LUTEAL ESTROGENI ConjugaŃi ai estradiolului induc regresia prematură a corpului luteal îmbunătăŃesc răspunsul axului hipotalamo-hipofizo-ovarian la progestageni interferează nidaŃia (căŃea) PGF2alfa produs natural al endometrului în absenŃa produsului de concepŃie PGF2alfa sau analogi sintetici induc regresia corpului luteal în perioada de susceptibilitate acŃiune uterotonică

Metode utilizate pentru inducerea estrului şi ovulaŃiei la FEMELELE ANESTRICE BOVINE RASE DE CARNE - femele impubere sau în anestru postpartum estrogen în Z1, urmat de progestagen timp de 7-12 zile şi PMSG în ultima zi (opŃional) majoritatea exprimă estrul în primele 5 zile după tratament VACI DE LAPTE ÎN ANESTRU POSTPARTUM GnRH în Z14 postpartum majoritatea ovulează în prima zi după tratament OVINE ŞI CAPRINE (anestru sezonier sau femele impubere) progestagen timp de 12-21 de zile, însoŃit de administrarea PMSG în apropierea sfârşitului perioadei majoritatea femelelor exprimă estrul la 2-4 zile după tratament PMSG îmbunătăŃeşte rezultatele SUINE PMSG singur sau PMSG în Z1 şi HCG la 48-96 de ore sau PMSG şi HCG în prima zi - la majoritatea femelelor estrul apare la 3-5 zile după tratament CABALINE ANESTRU SEZONAL lungirea fotoperioadei cu 4 ore pe zi la majoritatea iepelor ciclul o să apară cu 4-6 săptămâni mai devreme faŃă de normal ANESTRU PROFUND progestagen timp de 15 zile majoritatea exprimă estrul la 1 săptămână după tratament Sincronizarea estrului la FEMELELE CICLICE BOVINE PGF2alfa a) depistarea estrului 5-6 zile şi IA; restul femelelor PGF în ziua 7 şi IA la estrul depistat b) PGF în Z1 şi IA celor intrate în estru în primele 5 zile; celelalte primesc PGF în Z11 şi Z12 şi IA la estru sau programată c) 2 X PGF la 11-12 zile interval şi IA la estrul exprimat sau IA programată; femelele rămân sincronizate 1-2 cicluri PROGESTAGEN + ESTROGEN Z1 - implant + injecŃie ; implant timp de 9 zile ; IA la estru exprimat sau programată ; estru la 3-5 zile după scoaterea implantului PROGESTAGEN + PGF2alfa progestagen timp de 7 zile şi PGF în Z6; IA la estru sau programată ; estru la 2-3 zile după administrarea PGF OVINE PROGESTAGEN + PMSG implant 12-14 zile şi PMSG la extragerea sa montă la estru exprimat sau IA dublă majoritatea - estru în primele 2 zile după PMSG PGF2alfa

2 X PGF2alfa la 9 zile interval montă la estru exprimat sau IA dublă majoritatea exprimă estru la 2-3 zile după a doua PGF CAPRINE PROGESTAGEN + PMSG implant 18-21 zile şi PMSG la extragerea sa montă la estru exprimat sau IA dublă majoritatea - estru în primele 2 zile după PMSG PGF2alfa 2 X PGF2alfa la 11-12 zile interval montă la estru exprimat sau IA dublă SUINE PROGESTAGEN administrat în furaj timp de 14-18 zile montă la estru exprimat (4-7 zile după sistarea progestagenului) ECVINE - progestagen - implant 15 zile ; montă la estru (4-7 zile) - PGF2alfa - 1/2 doză în diestru ; montă la estru (după 3-5 zile) - PGF2alfa + HCG : PGF în Z1, HCG în Z7 sau Z8, PGF în Z15, HCG în Z21 sau Z22 .Estru va apărea la majoritatea femelelor la 2-4 zile după terminarea tratamentului

Strategii ANTILUTEOLITICE Creşterea dimensiunii foliculului preovulator, pentru a genera un CL mai mare (implant) Sporirea ratei de creştere a CL (implant cu GnRH) Creşterea nivelului circulant al P4 (inducerea unui CL accesoriu cu HCG) Scăderea efectului exercitat de foliculul dominant în perioada critică (cu GnRH, care îl deturnează şi scade E2) Creşterea amplitudinii semnalului antiluteolitic emis de produsul de concepŃie (administrarea bIFNt) Scăderea răspunsului luteolitic de la nivelul organismului matern (PUFA, AINS)

EMBRIOTRANSFERUL embrionii generaŃi în tractul genital al unei femele (donatoarea) sunt trasnferaŃi în uterul altei femele (receptoarea), în vederea ducerii gestaŃiei la bun sfârşit etapele embriotransferului: • sincronizarea femelelor • supraovulaŃia • fecundaŃia • colectarea embrionilor • examinarea embrionilor • (conservarea) • transferul la femela receptoare

Embriotransferul la BOVINE AplicaŃii: Sporirea numărului descendenŃilor proveniŃi de la vacile genetic superioare; Accelerarea testării descendenŃilor; Reducerea intervalului dintre generaŃii prin supraovularea viŃelelor prepuberale şi transferul embrionilor la recipiente mature, astfel putându-se accelera şi selecŃia genetică; Transportul internaŃional al embrionilor, astfel încât să se prevină problemele ridicate de răspândirea bolilor şi necesitatea carantinei (fiind necesară luarea în considerare a riscului difuzării afecŃiunilor virale); Investigarea mortalităŃii embrionare; ObŃinerea embrionilor de la vaci cu afecŃiuni care nu le permit ducerea gestaŃiei la termen; Utilizarea ET ca mijloc de cercetare ştiinŃifică. selecŃia donatoarelor Pot fi selectate vaci considerate potrivite de către proprietar. Vacile trebuie să aibă cel puŃin două luni de la parturiŃie. Femela trebuie să prezinte o activitate normală de reproducŃie, precum şi o structură normală a aparatului genital. selecŃia receptoarelor Se impune ca acestea să prezinte dimensiuni corporale potrivite şi maturitate morfologică astfel încât să poată făta eutocic. Trebuie să posede o funcŃie normală de reproducŃie (funcŃional şi structural). Ultima fătare trebuie să se fi produs cu cel puŃin două luni în urmă. aspecte imunologice RedirecŃionarea răspunsului imun de la imunitatea celulară. ToleranŃă tranzitorie faŃă de antigenele produsului de concepŃie. Activarea populaŃiilor specifice de limfocite implicate în imunosupresie sau a eliberării citokinelor care stimulează funcŃia placentară. Embriotransferul la RUMEGĂTOARELE MICI talia redusă a femelelor anatomia complexă a cervixului caracteristici ET la rumegătoarele mici 8-12 embrioni per donatoare 4-6 calităŃi necesare transferului rezultă 2-4 produşi programele de congelare reduc rata fătărilor cu 40% caprele - sensibile la stres (luteoliză prematură) protocoale ET inducere şi sincronizare estru (pesarii cu progestagene - 14 z ovine şi 16 caprine şi 500 UI PMSG la extragere) supraovulaŃia (FSH sau PMSG adm. în apropierea momentului extargerii pesariilor) recuperarea şi transferul embrionilor (chirurgical sau laparoscopic)

Embriotransferul la ECVINE fiziologia reproducerii sincronizarea ovulaŃiei recuperare embrioni 70-80% reuşită de 50% (metode nechirurgicale) şi de 70% (GIFT) sincronizarea ovulaŃiei armăsarul poate fi disponibil doar o perioadă limitată de timp; din motive comerciale se impune concentrarea perioadelor de gestaŃie-fătare; pentru embriotransfer, este obligatoriu ca donatoarea şi receptoarea să ovuleze în interval de 24 de ore. progesteronul şi progestagenele, utilizate ca atare pot suprima estrul şi ovulaŃia la iepe dar nu sunt eficace pentru sincronizarea ovulaŃiei în interval de 1-2 zile, interval necesar pentru embriotransfer şi montă în intervalul unei singure zile. Protocoale sincronizare: GnRH şi PGF2alfa PGF2alfa şi HCG estradiol + progesteron (+ PGF2alfa), administrate timp de 10 zile, în prima săptămână după ovulaŃie estradiol + progesteron + PGF2alfa şi HCG în ziua 2-3 a estrului indus (sincronizare de 90-95%) 2 administrări de PGF2alfa (la 14-18 zile) şi HCG după 2 zile, sincronizare de 60-72% ET la ecvine – caracteristici: recoltarea embrionilor (ziua a 9-a) supraovulaŃia (FSH ecvin) crioconservarea embrionilor (la 6 zile, viabilitate superioară) alte tehnici de reproducere asistată: GIFT ; IVF şi ICSI Embriotransferul la SUINE metode chirurgicale prin excelenŃă (rata medie a gestaŃiei - 60%, cu 6.5 descendenŃi) laparoscopie (dotări, anestezie) procedee nechirurgicale (rezultate inconstante, G între 9 şi 64%) adm. progestagenelor în ziua a 9-a a G îmbunătăŃeşte rata concepŃiei de la 40 la 60% coarne uterine scurtate (şi anastomozate) Embriotransferul la PISICĂ ovulaŃia provocată de stimulii mecanici !!! donatoare tratate cu gomadotropine (FSH administrat timp de 3-8 zile consecutiv a indus intrarea în estru în afara sezonului de montă) menŃinerea gestaŃiei la receptoare reprezintă o problemă


CURSUL nr. 4 tehnici de reproducere asistată in vitro • • • •

maturarea in vitro a ovocitelor şi embrionilor fecundaŃia in vitro clonarea transgeneza

maturarea ovocitară presupune: • ruperea membranei nucleare • completarea primei diviziuni meiotice şi expulzia primului globul polar ; rezultă ovocita secundară. Se formează placa metafazică pentru cea de-a doua diviziune meiotică • ovulaŃia asigurarea condiŃiilor optime permite maturarea ovocitară in vitro • se recoltează ovocite din foliculi maturi • se cultivă în medii de cultură suplimentate cu gonadotropine şi steroizi bovine • OPU - aspirare transvaginală ghidată ecografic • IVM - medii de cultură + steroizi + celule ale granuloasei sau linii celulare speciale • IVF - ovocită + spermatozoizi • IVC - embrion + mediu special (SOF) • IVP = IVM + IVF + IVC Cabaline • rată scăzută a IVF • reuşita IVC condiŃionată de mediul de cultură - în general comercial (15%), dar dacă se adaugă lichid folicular, se ajunge la atingerea metafazei II în 68,5% din cazuri Porcine obstacole: • maturarea ovocitelor (nucleară şi citoplasmatică) • dezvoltarea de la stadiul de unică celulă la blastocist • polispermia

fecundaŃia in vitro etapele esenŃiale ale fecundaŃiei • ataşarea gameŃilor • blocarea polispermiei • formarea pronucleilor (femel şi mascul) • unirea pronucleilor • amfimixia fecundaŃia in vitro (IVF) • ovocitele reiau meioza - competenŃă meiotică • colectarea şi capacitarea spermatozoizilor • colectarea şi fecundarea ovocitelor condiŃiile necesare realizării IVF • maturarea nucleară şi citoplasmatică a gameŃilor în gonade • dezvoltarea capacităŃii fecundante a gameŃilor în tracturile reproductive ale masculului şi femelei • un număr optim de spermatozoizi cu capacitate fecundantă normală şi mişcări viguroase • o ovocită fecundabilă care să posede deja primul globul polar

CLONAREA ansamblul de tehnici prin care se pot produce pe cale asexuată, celule sau organisme IDENTICE din punct de vedere genetic • injectarea intracitoplasmatică a spermatozoidului • transferul nuclear ICSI = Injectarea Intracitoplasmatică a Spermatozoidului • etapele premergătoare fecundaŃiei • zigoŃii generaŃi prin ICSI: remodelări nucleare anormale ; afectarea cromatinei pe parcursul decondensării ADN • organismele obŃinute consecutiv ICSI: ➲ infertilitate crescută la masculi ➲ aberaŃii cromozomiale la hetero- şi autozomi ➲ anomalii mentale, fizice, reproductive ROSNI = Tehnica Injectării Intracitoplasmatice a Nucleului Spermatidelor Rotunde dacă nucleul spermatidei posedă o capacitate redusă de a activa ovocita, se impune şi aplicarea unui tratament de activare a ovocitei transferul nuclear introducerea nucleului aparŃinând unei celule totipotente (ovocită fecundată sau zigot) donatoare într-o ovocită matură enucleată • embrionul dezvoltat va fi transferat unei mame surogat pentru a se dezvolta în continuare

totipotenŃa • potenŃialul de a iniŃia şi regla un proces normal de dezvoltare • OVOCITA FECUNDATĂ şi ZIGOTUL au proprietatea de a genera un nou organism = TOTIPOTENTE • materialul genetic donator este introdus în citoplasma reecptoarei prin fuziunea realizată între celulele donatoare şi receptoare • se produce implicit introducerea materialului genetic şi a citoplasmei • nucleul donator (şi NU celula receptoare) trebuie să răspundă provocărilor noului mediu, din acest motiv nucleul putând fi definit drept TOTIPOTENT etapă: înlăturarea materialului genetic din ovocita receptoare (enucleerea) • înlăturarea unor componenŃi citoplasmatici şi reducerea viabilităŃii citoplasmei • descreşterea numărului total de celule ale blastociştilor clonaŃi • numărul redus de celule determină gradul redus de viabilitate a embrionilor clonaŃi sincronizarea ciclurilor celulare între carioplastul donator şi citoplasma receptoare remodelarea nucleară şi sinteza de ADN sunt desăvârşite în primele 24 de ore consecutiv transferului nuclear în ovocita enucleată sincronizarea ciclurilor celulare: • blocarea embrionilor în profază prin intermediul unor agenŃi medicamentoşi care împiedică funcŃionarea citoscheletului pre-activate, pe post de • întrebuinŃarea ovocitelor enucleate citoplasmă Nucleii donatori trebuie să fie în fazele G0 sau G1, altminteri rezultă alterări ireversibile ale cromatinei şi aneuploidie Lungimea primului ciclu celular al embrionului determină capacitatea de supravieŃuire (dacă este mai lung, rezultă embrioni viabili) Reprogramarea nucleară • evoluŃia de la stadiul de ZIGOT la stadiul de BLASTOCIST, a necesitat un interval identic de timp pentru embrionii obŃinuŃi prin fecundare sau transfer nuclear • nucleii donatori au fost reprogramaŃi (s-au întors în acelaşi cadru de dezvoltare morfologică şi temporală ca şi zigotul) Dominko şi col., 1998 citoplasma ovocitelor de bovine deŃine capacitatea de a reprograma nucleii celulelor somatice proveniŃi de la diferite specii de mamifere şi de a iniŃia dezvoltarea embrionară timpurie

Progresele realizate în domeniu 23 februarie 1997 - Cercetătorii de la Institutul Roslin din ScoŃia anunŃă reproducerea cu succes a oii Dolly, după o lungă şi atentă verificare a purităŃii genelor. Data reală de naştere a lui Dolly a fost 5 iulie 1996. 4 martie 1997 - Preşedintele SUA, Bill Clinton semnează un ordin executiv care interzice utilizarea de fonduri federale pentru clonarea umană, invocând „profunde aspecte etice”. Iulie 1997 - Cercetătorii britanici care o clonaseră pe Dolly o clonează pe Polly, care poartă gene umane. Se exprimă speranŃa în clonarea unei întregi turme de oi identice care să poată produce proteine umane pentru uz medical. Mai 1999 - Institutul Roslin este cumpărat de compania americană de biotehnologie Geron Corp. La scurt timp, Japonia, India şi majoritatea Ńărilor europene condamnă clonarea sau impun legi speciale pentru controlul cercetărilor. Februarie 2002 - Cercetătorii japonezi, care clonaseră cel puŃin zece şoareci, anunŃă că toŃi muriseră prematur. O umbră de îndoială afectează siguranŃa clonării. În aceeaşi lună se anunŃă că şoarecii clonaŃi deveniseră obezi. Februarie 2002 - Cercetătorii de la Texas A and M University anunŃă clonarea unei pisici. Au prezentat-o la vârsta de două luni şi au botezat-o CC, de la „carbon copy” („copie la indigo”). Noiembrie 2002 - Dr. Severino Antinori, expert italian în fertilitate, anunŃă că o pacientă a sa aşteaptă naşterea primului copil clonat în luna ianuarie 2003 şi că mai există alte două femei care poartă embrioni clonaŃi. CLONAID - Decembrie 2002. Clonaid, o companie asociată cu un grup care crede că omenirea a fost creată de extratereştri prin clonare, anunŃă că primul copil clonat se va naşte până la sfârşitul anului. Decembrie 27, 2002. Clonaid anunŃă prima clonă umană, o fetiŃă de 3.1 kg, născută prin cezariană în SUA, în data de 26 decembrie. Numele său este Eva. O altă clonă este aşteptată să se nască în următoarele săptămâni în Europa. Ianuarie 3, 2003. Se anunŃă naşterea celei de-a doua clone, tot o fetiŃă, părinŃii fiind un cuplu de lesbiene din Olanda. Ianuarie 22, 2003. Se anunŃă naşterea celei de-a treia clone, de data asta un băieŃel, în Japonia. Ca şi în celelalte cazuri, Clonaid nu pune la dispoziŃie nici un fel de date pentru verificare, iar părinŃii Evei refuză testul genetic. 14 februarie 2003 - Dolly este eutanasiată. Avea doar şase ani – cel mult jumătate din vârsta pe care ar fi putut-o atinge. Fusese clonată folosind celule de la o oaie care în momentul respectiv avea ea însăşi şase ani. După o artrită, s-a îmbolnăvit grav de plămâni (cancer de origine virotică). În 1998 dăduse naştere în mod natural lui Bonnie, iar în anul următor mai avusese trei miei. În momentul de faŃă, în lume există câteva sute de animale clonate, unele ajungând chiar pe piaŃa de carne.

14 august 2003 - Specialiştii chinezi folosesc pentru prima oară tehnica clonării pentru a crea embrioni hibrizi conŃinând un amestec de ADN de iepure şi om. Se anunŃă totodată că embrionii obŃinuŃi au fost imediat distruşi. Dar dezbaterea etică privind clonarea este relansată … RISCURILE CLONĂRII procent crescut de eşecuri - rata succesului în cazul TN variază între 0,1 şi 3% (din 1000 de încercări, rezultă între 1 şi 30 de clone) ovocita enucleată şi nucleul transferat pot fi incompatibile ovocita cu noul nucleu poate să nu se dividă sau dezvolta corespunzător implantarea embrionului poate eşua gestaŃia poate eşua probleme în dezvoltare LOS – clonele au organele interne anormal de mari – probleme respiratorii, circulatorii şi de altă natură deoarece LOS nu apare întotdeauna, nu se poate prevedea care clone îl vor exterioriza unele clone fără LOS au malformaŃii renale sau cerebrale, disfuncŃii imunitare, generând probleme ulterioare deficienŃe imunitare viŃeii produşi prin clonare au evidenŃiat deficienŃe în funcŃionarea sistemului imunitar scăderea imunităŃii este normală odată cu îmbătrânirea dar la animalele clonate este accelerată, determinând apariŃia pneumoniilor şi altor insuficienŃe imunitare la şoarecii clonaŃi, morbiditatea şi mortalitatea crescute s-au datorat disfuncŃiilor hepatice şi pulmonare modalităŃi anormale de exprimare a genelor în embrionul natural, ADN-ul este programat să exprime UN ANUMIT set de gene. pe măsura diferenŃierii celulelor embrionare, programul se modifică pentru fiecare tip de celule diferenŃiate (piele, elemente sanguine, Ńesut osos sau nervos, de exemplu) programele sunt diferite la clone, nucleul transferat NU are acelaşi program ca embrionul natural. Reprogramarea completă (artificială – realizată de om) este necesară dezvoltării cât mai apropiate de normal. Reprogramarea incompletă condamnă embrionul. telomerii telomerii – secvenŃe terminale ale ADN alcătuite din repetări ale TTAGGG. la fiecare diviziune telomerii se scurtează câte un pic, până ajung atât de scurŃi încât nu mai sunt posibile diviziuni prezenŃa lor la capătul cromozomilor previne pierderea materialului genetic pe parcursul diviziunilor, precum şi alipirea accidentală a capetelor diferiŃilor cromozomi telomeraza

enzima (ribonucleoproteină) care adaugă secvenŃe repetate de telomer la capătul 3‘ al ADN-ului se găseşte în celulele germinale se găseşte în celulele canceroase în unele tipuri de celule umane, scurt timp, de-a lungul fazei S a ciclului celular activitate INTENSĂ în blastocişti, sistemele IVF, partenogenetice şi de TN la om şi şoarece a fost evidenŃiat un mecanism de reprogramare a telomerazei pe parcursul dezvoltării embrionare timpurii embrionii clone bovine au evidenŃiat o dinamică a telomerazei similară cu cea a embrionilor generaŃi prin IVF sau PA telomerii şi îmbătrânirea majoritatea celulelor de om se divid de 30-50 de ori înainte de a-şi înceta reproducerea, ajungând la senescenŃă se admite că senescenŃa este legată de lungimea telomerilor deoarece prin adăugarea telomerazei, enzima care lungeşte telomerii, celulele se pot reproduce la infinit telomerii şi cancerul telomeraza este enzima care reglează orarul mitotic sau celular; telomeraza lungeşte şi consolidează telomerii scurtaŃi, înlocuind fragmentele de ADN pierdute pe parcursul diviziunilor obişnuite la om, există tot mai multe dovezi că telomerii scurŃi contribuie direct la declanşarea fazelor timpurii în anumite tipuri de cancer telomeraza se regăseşte în peste 90% din formele de cancer întâlnite la om diferenŃe ale telomerilor lungimea telomerilor (secvenŃele de ADN de la capetele cromozomilor) scade pe măsura parcurgerii diviziunilor celulare, fiind un etalon al vârstei telomerii cromozomilor aparŃinând VACILOR sau ŞOARECILOR clonaŃi sunt MAI LUNGI decât normalul la OAIE (vezi Dolly) sunt MAI SCURłI – îmbătrânire mai rapidă ?

transgeneza rezultatul injectării directe a genelor străine în celula primordială a unui organism în dezvoltare animalele transgenice pot exterioriza o largă varietate de noi fenotipuri consecutiv exprimării ADN-ului moleculelor exogene tehnologia transgenică = transferul unui segment de ADN supus ingineriei genetice (o “construcŃie” de ADN) în materialul genetic al altei (altor) specii TT - în laptele vacilor: • promotorul genei β-globulinei (orice proteină) • alfa1-antitripsina (tratament fibroza chistică) • fibrinogen (hemostaza în plăgile de mari dimensiuni)

•

lipază (tratament de substituŃie în pancreatite)

XENO-TRANSPLANTUL = utilizarea organelor provenite de la alte specii (animale) SUA: • la fiecare 16 minute un nume nou se adaugă listei de aşteptare • zilnic mor 11 pacienŃi în aşteptare • anual : 30 miliarde dolari cheltuiŃi cu pacienŃii aflaŃi în stadiile finale ale afecŃiunilor fatale

supravieŃuirea organelor transplantate incorporarea în sistemul circulator al corpului omenesc interfaŃa dintre afluxul sanguin al corpului omenesc şi organul transplantat (porc) respingerea grefelor • supra-acută • tardivă (DXR = delayed xenograft rejection) • pe termen lung (LTR = long time rejection) potenŃialele consecinŃe ale utilizării tehnicilor de reproducere asistată asupra stării de bine (welfare) a animalelor ovulaŃiile multiple şi ET transferul embrionilor rezultaŃi în urma poliovulaŃiei: • creşterea procentului mortalităŃii embrionare • viŃei mai voluminoşi • durată mai lungă a gestaŃiei • indicenŃă crescută a distociilor (cezariene) inducerea poliovulaŃiei • asincronie în dezvoltarea foliculului preovulator precum şi în procesul meiotic al ovocitei • creşterea unei întregi cohorte de foliculi înseamnă un nivel anormal de mare al estrogenilor înaintea ovulaŃiei şi al progesteronului după ovulaŃie nivelurile crescute ale E2 • afectează organizarea microtubulilor • afectează meioza • afectează eliberarea primului globul polar nivelurile ridicate ale P4 afectează mediul uterin determinând asincronia între stadiul de dezvoltare embrionară şi mediul uterin la momentul transferului concret:

• • •

•

Dorland şi col. (1993) - % crescut de embrioni mixoploizi, 1 haploid şi 1 triploid consecutiv inducerii superovulaŃiei Viuff şi col. (1999) - mixoploidii la 72% dintre blastociştii bovini produşi in vitro Karwaski şi col. (1996) - 27-45% din embrionii rezultaŃi în urma supraovulaŃiei au o cariogramă anormală - mor la scurt timp după implantare embrionii au aspect corespunzător şi vor fi transplantaŃi

Sinclair şi col. (1997) - ritm de creştere diferenŃiat pentru organele interne (ficat, inimă, rinichi şi glande suprarenale) consecutiv IVP Farin şi col. (2000) - învelitorile fetale - modificări macroscopice şi histologice Hill şi col. (2000): aproape 50% din fetuşii clonaŃi se pierd între zilele 30 şi 90 ale gestaŃiei (FAłĂ de 2-4% NORMAL) ; în jurul zilei 40 a gestaŃiei este evidentă dezvoltarea anormală a placentoamelor

Chavette-Palmer şi col. (2000) -necropsierea fetuşilor sau viŃeilor rezultaŃi din clone: • steatoză hepatică asociată cu dezvoltarea asincronă a organelor • hidropizia anexelor fetale • disfuncŃii metabolice şi ale funcŃiei de creştere • insuficienŃă placentară în gestaŃia avansată • afectate nivelurile IGF-urilor transgeneza • exprimarea unei transgene şi procesul de sinteză şi eliberare a unei proteine se realizează concomitent • procese complexe (ex: imunitatea sau funcŃia de creştere) mediate prin nenumărate gene, care operează într-un complex de factori reglatori • ECHILIBRU DELICAT !!!!!!!!! Animal Welfare (starea de bine a animalelor) • definirea stării de bine a animalelor (comparaŃii cu lot martor) • Biotechnology Industry Organization (www.bio.org) • raŃiunea şi spiritul de prevedere confruntate cu ignoranŃa şi orgoliul


CURSUL nr. 5 Reglarea funcŃiei de reproducere la mascul Procesele reproductive desfăşurate în organismul masculului sunt reglate printr-o buclă scurtă, una lungă şi una ultra-scurtă. Bucla lungă implică interacŃiunile dintre FSH –inhibină şi LH – testosteron. Bucla scurtă dintre epiteliul interstiŃial şi cel seminifer implică factori de creştere şi hormoni. Bucla ultrascurtă reglează interacŃiunile dintre celulele Sertoli. cele germinale şi cele musculare. Câteva dintre proteinele circulante sunt incluse prin compartimentul bazal în celulele Sertoli prin mecanisme endocrine: transferina, ABP, IGF şi factorii de creştere înrudiŃi. Proteinele secretate de celulele Sertoli în compartimentul adluminal sunt incluse printr-un mecanism paracrin în celulele germinale. Spermatocitele şi spermatidele tinere reprezintă Ńinta predilectă pentru proteinele produse în celulele Sertoli. Celulele Sertoli şi Leydig Celulele Sertoli şi cele germinale îşi reglează reciproc secreŃia ciclică a proteinelor pe parcursul lungimii tubului seminifer, iar celulele mioide amplifică acest proces prin intermediul factorilor de transformare şi creştere, a modulatorilor umorali precum şi prin intermediul matricei extracelulare. Celulele Sertoli sunt prevăzute cu căi pentru transportul intracelular al metaboliŃilor celulari, care coordonează activitatea epiteliului seminifer. Activina şi inhibina Această familie a glicoproteinelor gonadale posedă mecanisme remarcabile pentru a genera semnale diverse. Modul diferit de asociere a subunităŃilor poate genera dimeri cu acŃiune biologică opusă în diferite Ńesuturi. Aceşti hormoni heterodimerici sunt alcătuiŃi dintr-o subunitate α şi una sau două subunităŃi β (βA sau βB) care suprimă secreŃia FSH din hipofiza anterioară. Activinele sunt dimeri puternic stimulatori ai eliberării FSH (dimeri ai subunităŃilor β ale inhibinei) şi sunt purificate din lichidele gonadale. ACT şi INH de asemenea acŃionează la nivelul gonadelor ca modulatori paracrini şi autocrini ai producerii steroizilor, factorilor de creştere şi altor hormoni. INH este un hormon glicoproteic produs de gonade pentru a regla secreŃia de FSH cu efect minim asupra producerii LH hipofizar. Numele de inhibină a fost folosit prima dată în 1932 pentru a denumi o substanŃă hidrosolubilă din testicul. Transferina β2, microglobulina şi albumina din plasma seminală

Nivelurile transferinei, β -microglobulinei şi albuminei din plasma seminală sunt corelate cu numărul de spermatozoizi. Aceasta este o relaŃie generală între proteinele din plasma seminală şi numărul de spermatozoizi; unele produse din spermă reglează transportul proteinelor plasmatice în plasma seminală. Transferina din plasma seminală poate fi folosită drept parametru clinic al funcŃionării celulelor Sertoli.

I. ROLUL ENDOCRIN AL TESTICULULUI 1. Locul de secreŃie al androgenilor (AND) Celulele interstiŃiale Leydig Din COL, sub influenŃa enzimelor mitocondriale, se sintetizează PREG , iar mai apoi, sub influenŃa enzimelor din reticulul endoplasmatic , rezultă TEST (testosteron). Celulele Sertoli sunt şi ele capabile să metabolizeze P4 în TEST iar pe acesta să îl transforme în 5αDHT (dihidrotestosteron) sau să îl aromatizeze în 17βE2 care se regăseşte în concentraŃii scăzute în testiculele numeroaselor specii. 2. CantităŃile de steroizi secretate În afara TEST, considerat hormonul masculin prin excelenŃă şi a 5αDHT, secretat în cantităŃi mai mici, se mai evidenŃiază în testicule şi ANDROSTENDIONUL precum şi DIHIDROEPIANDROSTERONUL. În urină a fost evidenŃiat ANDROSTERONUL, de 10 ori mai puŃin activ decât testosteronul. ImportanŃa cantităŃii steroizilor secretaŃi variază cu vârsta animalului. Valorile absolute cresc de la naştere spre vârsta adultă. Semi-viaŃa biologică a TEST în sângele periferic este scurtă, de ordinul minutelor. 3. Modul de evacuare a androgenilor Se face întotdeauna prin sângele venos, consecinŃa fiind apariŃia caracterelor sexuale primare şi secundare, manifestarea comportamentului sexual şi retroacŃiunea negativă asupra axului hipotalamo – hipofizar. Androgenii pot fi evacuaŃi, în cantităŃi mult reduse şi prin lumenul tubilor seminiferi, rete testis şi epididim. Transferul este posibil datorită ABP (androgen binding protein), secretată de către celulele Sertoli. ABP are afinitate crescută pentru TEST şi DHT, facilitându-le pasajul în tubii seminiferi şi contactul cu celulele germinale. În acest mod, androgenii stimulează spermatogeneza. 4. Roluri fiziologice - dezvoltarea caracterelor sexuale secundare; - acŃiune anabolizantă (influenŃa exercitată asupra musculaturii) - stimularea spermatogenezei - retrocontrolul negativ asupra descărcării de FSH şi LH.

II. CONTROLUL HIPOFIZEI ANTERIOARE ASUPRA PRODUCERII ANDROGENILOR ŞI SPERMATOGENEZEI 1.Efectul gonadotropinelor hipofizare asupra secreŃiei androgenilor ICSH favorizează activarea ADENILCICLAZEI (AC) din celulele interstiŃiale, permiŃând transformarea ATP în AMPc. Acest nucleotid joacă un rol esenŃial în transformarea COL în PREGNENOLON. Stimularea producerii TEST se realizează prin acŃiunea sinergică a ICSH şi FSH. Mecanismul de acŃiune se evidenŃiază la nivelul celulelor Sertoli. FSH stimulează metabolizarea P4 în TESTOSTERON. LTH (PRL) deŃine un rol pozitiv în steroidogeneză prin creşterea numărului de receptori pentru ICSH şi a acumulării de colesterol intracelular. Completează acŃiunea principală a ICSH. 2. Rolul hipofizei anterioare în spermatogeneză -

influenŃează volumul (masa) testiculelor; influenŃează numărul celulelor germinale precum şi procesul acestora de diviziune şi maturare; influenŃează durata ciclului epiteliului seminifer.

III. CONTROLUL ENDOCRIN AL REPRODUCłIEI LA MASCUL a. ICSH stimulează celulele Leydig rezultând o descărcare de TEST; b. TEST traversează celulele Sertoli sau sunt captate de ABP şi parŃial transformat în DHT; c. rolul principal al FSH este de a stimula funcŃionarea celulelor Sertoli şi de a spori formarea ABP; d. după trecerea în celulele Sertoli, o parte din androgeni (consideraŃi drept principalii stimulatori ai spermatogenezei), “îmbibă” celulele germinale pentru a le dirija diviziunea şi diferenŃierea; e. sub influenŃa funcŃionării intense a celulelor germinale, celulele Sertoli eliberează în sânge cantităŃi crescute de INHIBINĂ, care va bloca descărcarea de FSH, prin aceasta menŃinând procesul spermatogenezei în limite “rezonabile”. f. feed-backul este exercitat în egală măsură şi de androgenii prezenŃi în circulaŃie care împiedică eliberarea de ICSH şi FSH. g. androgenii circulanŃi contribuie în egală măsură la stimularea caracterelor sexuale primare şi secundare precum şi a comportamentului sexual. h. influenŃa factorilor de mediu, în speŃă a luminii, care prin intermediul SNC şi a epifizei controlează hipotalamusul, respectiv eliberarea GnRH şi consecutiv, funcŃiile hipofizare.

IV. INFLUENłA ANOTIMPULUI ŞI A FACTORILOR DE MEDIU ASUPRA REPRODUCłIEI LA MASCUL

A. Exemple de influenŃe exercitate asupra reproducŃiei la berbec 1. VariaŃia greutăŃii şi a activităŃii testiculare Rasa Ile de France: intervalul decembrie –mai, testiculele cântăresc 210 grame iar în intervalul iunie-octombrie, 285 grame, rezultând diferenŃe de 3540% volumul Ńesutului interstiŃial creşte cu 55% volumul tubilor seminiferi creşte cu 50% mărimea nucleilor celulelor Sertoli creşte cu 20% nr. total de spermatogonii creşte cu 60% Studiu făcut pe Merinos, cu aceleaşi perioade de referinŃă indică: producŃie spermatică cotidiană – 1x109 şi 4,8x109 rezervele epididimare: 25x109 şi 60x109 spermatozoizi procentul spermatozoizilor anormali este maxim în martie-aprilie (30%) şi minim în septembrie-octombrie (10%) 2. VariaŃia greutăŃii şi activităŃii glandelor anexe Activitatea glandelor accesorii (apreciată prin greutatea veziculelor seminale) cunoaşte aceeaşi curbă crescătoare ca şi spermatogeneza. Din iulie până în decembrie, cantitatea totală de fructoză (101,5) este dublă faŃă de cea observată între ianuarie şi iunie (51,5). La taur, care este puŃin sensibil la variaŃiile sezoniere, singura caracteristică care parcurge un ciclu anual evident este conŃinutul în fructoză, care este scăzut în mai, iunie, iulie, decembrie, ianuarie şi crescut în martie şi septembrie (echinoxul). 3. VariaŃia activităŃii endocrine Activitatea testiculelor şi a glandelor anexe depinde de variaŃia nivelului de LH, care este scăzut în decembrie şi mai (6,75 µg) şi ridicat între iunie şi noiembrie (11,25 µg). Nivelul LH sanguin este foarte crescut la începutul sezonului de montă, numărul pulsiunilor fiind de aproximativ 9 pe zi. B. InfluenŃa duratei zilei-lumină Activitatea hipofizo-testiculară la berbec se intensifică atunci când luminozitatea zilnică atinge 9-10 ore. KARSCH şi col. (1984): influxul nervos provocat de lumină prin fotoreceptorii retinieni este condus prin nucleul suprachiasmatic şi ganglionul cervical superior la epifiză. Epifiza traduce influxul prin secreŃie de MELATONINĂ, care este sporită pe parcursul fazei nocturne. Astfel, melatonina intervine în schema de secreŃie a LH, prin modularea producerii GnRH.

C. InfluenŃa temperaturii În principiu, temperaturile ridicate nu influenŃează funcŃia endocrină a testiculului, afectând însă, în cazul expunerilor prelungite procentul spermatozoizilor mobili, frecvenŃa anomaliilor capului şi cozii precum şi procentul ovocitelor fecundate.

SPERMATOGENEZA Schema diviziunilor succesive Spermatozoizii sunt rezultatul unor transformări complexe (diviziuni şi diferenŃieri celulare) care se derulează în peretele tubilor seminiferi, fiecare fază având importanŃă în volumul şi calitatea finală a produsului elaborat. Celulele germinale, succesiv diviziunilor şi diferenŃierilor, migrează de la membrana bazală a tubului seminifer spre lumenul acestuia, rămânând însă tot timpul ataşate celulelor “nutritive” Sertoli. La început, spermatogoniile, reprezentând celule stem relativ nediferenŃiate, se multiplică prin mitoză la nivelul membranei bazale a tubilor seminiferi, de-a lungul căreia sunt dispuse. Acest proces se produce la nivelul compartimentului bazal al tubilor seminiferi. Spermatogeneza asigură atât producerea ciclică a spermatocitelor primare cît şi menŃinerea constantă a numărului celulelor stem. În plus faŃă de această masă gata de diviziune, există şi o rezervă de spermatogonii care nu proliferează şi care sunt extrem de rezistente la acŃiuni ale radiaŃiilor sau substanŃelor toxice. Aceste celule supravieŃuiesc chiar şi traumatismelor suferite de testicul. Restul proceselor au loc în compartimentul lumenal în care spermatocitele primare parcurg meioza pentru a produce spermatocite secundare. Acestea la rândul lor suferă o diviziune meiotică pentru a produce spermatidele. Prima etapă: diviziunile spermatogoniale Un stoc de spermatogonii suşe de rezervă (spermatogonii A0 ), provenite din gonocite şi constituite în special înainte de pubertate, se divid, fără a se putea preciza exact numărul diviziunilor. Pe parcursul dezvoltării embrionare, celule speciale denumite celule germinale primordiale migrează din regiunea sacului embrionar în gonadele nediferenŃiate. După ce ajung la gonadele fetale, celulele primordiale se divid de câteva ori înainte de a forma celulele denumite gonocite. La mascul, aceste gonocite par să parcurgă diferenŃierea chiar înaintea pubertăŃii pentru a forma spermatogonia A0, care stă la originea celorlalte celule germinale. Sub influenŃa hormonilor antehipofizari gonadotropi LH şi FSH, aceste spermatogonii A0 se vor putea divide în noi spermatogonii suşe (A0 şi A1). Spermatogoniile suşe A1 sunt mai diferenŃiate şi continuă diviziunile ulterioare pentru ca peste 46 – 49 de zile să devină spermatozoizi, în timp ce spermatogoniile A0 rămân (la adult) de rezervă un timp variabil, permiŃând relansarea activităŃii spermatogenice în anumite perioade ale anului (sezon sexual).

Spermatogoniile A1 se divid, rezultând spermatogonii A2. Acestea (A2) vor furniza spermatogoniile A3 (mai diferenŃiate, fiind numite spermatogonii active) precum şi spermatogonii suşe A1 (noi), denumite spermatogonii “imobile”. Spermatogoniile “imobile” A1 rămân în repaus până la următorul ciclu spermatogenic, când ele vor juca rolul spermatogoniei suşe care va genera A2 apoi A3 şi A1 etc. În acest mod, spermatozoizii formaŃi vor fi întotdeauna tineri deoarece diviziunea care dă naştere celulelor mamă este relativ recentă. Spermatogoniile active A3 intră imediat în diviziune şi se observă 4 mitoze succesive (la berbec şi taur, deoarece acest număr este diferit la alte specii) care conduc la formarea succesivă de celule denumite : spermatogonii intermediare, spermatogonii B1, spermatogonii B2 şi spermatocite primare. La câine se consideră că există şi spermatogoniile A4, care îndeplinesc aceleaşi roluri ca şi A3 la alte specii (Hewitt – 1998). Există diferenŃe între modurile de clasificare a spermatogoniilor, iar la anumite specii, se evidenŃiază trei şi nu patru tipuri de spermatogonii. Spermatocitul primar este în realitate o spermatogonie care intră în meioză. Această etapă a diviziunilor spermatogoniale este, în mare parte, responsabilă de producŃia cantitativă de spermatozoizi din cel puŃin trei motive: a) există corelaŃie pozitivă între: - numărul total de celule somatice Sertoli, stabilit înainte de pubertate şi cel al spermatogoniilor suşe A1 din testicul; - numărul total de celule suşe A1 din testicul şi producŃia cotidiană de spermatozoizi. b) numărul de diviziuni între spermatogonia suşă A1 şi ultima generaŃie spermatogonială este crescut şi spermatogonia A1 imobilă a liniei spermatice următoare se izolează târziu, în plus numărul de celule fiice pe celulă suşă este important. c) în cursul diviziunilor spermatogoniale ( între A2 şi B2) apare un număr foarte mare de degenerescenŃe: 2/3 din producŃia teoretică este pierdută la taur, aproximativ jumătate la berbec sau şobolan. Aceste degenerescenŃe sunt sub control endocrin gonadotrop. VariaŃiile luminoase sezoniere joacă, în această privinŃă un rol important la berbec. A doua etapă: meioza, diviziunea spermatocitelor şi formarea spermatidelor Spermatocitele I (2n cromozomi) provenite din diviziunea ultimei generaŃii spermatogoniale, suferă reducerea cromatinică (prima diviziune reducŃională) după o lungă profază meiotică şi dau naştere spermatocitelor II cu n cromozomi care după o viaŃă foarte scurtă se divid în spermatide (a doua diviziune ecvaŃională). Această etapă permite trecerea de la valoarea tetraploidă a genomului (2n cromozomi sub formă de tetrade) din spermatocitele I în profază, la valori haploide care caracterizează gameŃii. La începutul acestei etape se produce ultima sinteză de ADN. Linia germinală şi câteva spermatocite părăsesc progresiv compartimentul bazal al tubului seminifer pentru a intra în compartimentul central, în interiorul barierei testiculare formate prin joncŃiunile foarte strânse dintre membranele citoplasmatice ale celulelor Sertoli învecinate.

Un număr mare de elemente trec spre compartimentul central traversând citoplasma sertolineană. În stadiul leptoten, cromozomii se individualizează, apoi, în stadiul zigoten se pliază (împachetează), în pahiten fiecare cromozom se “îngroaşă”, în diploten se produce dispersia cromozomilor, tetradele fiind foarte evidente. În timpul diachinezei, cromozomii foarte spiralaŃi nu sunt ataşaŃi decât prin “chiasma”. În timpul acestor faze, mitocondriile suferă modificări importante însoŃite de hipertrofierea cristelor. Durata vieŃii spermatocitelor I este variabilă de la o specie la alte dar constantă în cadrul aceleiaşi specii. Hipofizectomia antrenează numeroase degenerescenŃe în cursul meiozei, în special în pahiten. Administrarea testosteronului corectează parŃial efectele (în cazul şobolanului). Prima diviziune reducŃională conduce la spermatocite II (cu n cromozomi), morfologic foarte diferite de spermatocitele I, fiind însă foarte asemănătoare (dar ceva mai mari) cu spermatidele rotunde care provin din a doua diviziune ecvaŃională. Procesul diviziunii poate fi uneori perturbat. Astfel, s-a evidenŃiat la taurii Charolaise prezenŃa spermatozoizilor diploizi (1,73 % din spermatozoizi prezentând un flagel dublu sau o piesă intermediară dublă). această anomalie ar putea fi dată de transformarea directă (în absenŃa celei de-a doua diviziuni meiotice de maturare) a spermatocitelor secundare în spermatide. Spermatidele pot suferi diferenŃierea în celule specializate mobile (spermiogeneza).

A treia etapă: (spermiogeneza)

transformarea

spermatidelor

în

spermatozoizi

Spermatida provenită în urma meiozei se va transforma în spermatozoid consecutiv unor modificări morfologice complexe. În funcŃie de evoluŃia nucleului spermatidelor, se pot distinge trei populaŃii: spermatidele cu nucleu rotund, spermatidele cu nucleu în alungire (oval) precum şi cele cu nucleu alungit. La nivelul citoplasmei, spermatida “suferă” transformări importante cu achiziŃionarea unei polarităŃi celulare, a unui aparat locomotor precum şi a unui echipament enzimatic, fiind capabilă de a ajunge la ovocită şi de a-i penetra citoplasma (în vederea fecundaŃiei). EvoluŃia citoplasmei spermatidelor a fost studiată graŃie tehnicii coloraŃiei PAS (care pune în evidenŃă glicoproteinele). A fost posibilă astfel urmărirea formării aparatului acrosomic precum şi definirea celor 4 etape succesive, respectiv fazele Golgi, cap, acrozomială şi de maturaŃie. FAZA GOLGI Este caracterizată prin formarea unor granule proacrozomale PAS-pozitive la interiorul aparatului Golgi, confluarea granulelor într-o singură granulă acrozomală, aderarea acestei granule rezultante la membrana nucleară precum şi stadiile timpurii ale dezvoltării cozii la polul opus celui la care aderă granula

acrozomală. Centriolul proximal migrează foarte aproape de nucleu, unde se presupune că formează o bază pentru ataşarea cozii la cap. FAZA CAP Este caracterizată prin difuzarea granulei acrozomiale aderente, pe suprafaŃa nucleului spermatidei. Acest proces continuă până când aproape două treimi din porŃiunea anterioară a nucleului fiecărei spermatide este acoperit de către o membrană subŃire, alcătuită din două straturi, aderând puternic la membrana nucleară. Pe parcursul acestei faze, componentele axonemale ale cozii aflate în dezvoltare, formate din elemente ale centriolului distal, se alungesc mult peste marginea citoplasmei celulare. Pe parcursul dezvoltării timpurii, axonema este foarte asemănătoare cu structura unui cil alcătuit din doi tubi centrali înconjuraŃi de nouă perechi de tubuli. FAZA ACROZOMIALĂ Este caracterizată prin modificări care survin la nivelul nucleului, acrozomului şi cozii spermatidelor în dezvoltare. Modificările sunt facilitate de rotaŃia fiecărei spermatide astfel încât acrozomul este direcŃionat către baza peretelui exterior al tubului seminifer iar coada este direcŃionată spre lumen. Modificările nucleare includ condensarea cromatinei în granule dense şi reformarea nucleului sferoidal într-o structură alungită, plată. Acrozomul, care este aproape aderent nucleului, de asemenea se condensează şi se alungeşte pentru a corespunde formei nucleului. Aceste modificări ale formei nucleului şi acrozomului par a fi modelate de către celulele Sertoli înconjurătoare. Modificările morfologice sunt uşor diferite pentru fiecare specie, aspect care se reflectă în particularităŃile spermatidelor şi spermatozoizilor. Modificările în morfologia nucleară sunt însoŃite de deplasarea citoplasmei spre capătul caudal al nucleului, unde înconjoară porŃiunea proximală a cozii în dezvoltare. În interiorul acestei citoplasme, microtubulii se asociază pentru a forma o cămaşă cilindrică numită manşetă , care se proiectează posterior de extremitatea caudală a acrozomului, unde subŃiindu-se înconjoară axonema. În manşeta cilindrică, o structură citoplasmică specializată denumită corpul cromatoid se condensează în jurul axonemei pentru a forma structura circulară cunoscută sub denumirea de anulus. Anulusul se formează la început lângă centriolul proximal şi pe parcursul dezvoltării sale migrează caudal de-a lungul cozii. Mitocondriile, care anterior au fost distribuite în citoplasma spermatidei, încep să se concentreze în apropierea axonemei, unde formează învelitoarea care caracterizează piesa mijlocie a cozii. FAZA DE MATURARE Implică transformarea finală a spermatidei alungite în celula care va fi eliberată în tubul seminifer. Remodelarea nucleului şi acrozomului fiecărei spermatide, iniŃiate pe parcursul fazei precedente va avea drept efect generarea spermatozoizilor caracteristici fiecărei specii. La interiorul nucleului, granulele de cromatină parcurg o condensare progresivă până când vor forma un material fin, omogen care va umple în mod uniform întregul nucleu al spermatozoidului. Pe parcursul fazei de maturare, în jurul axonemei se formează un înveliş fibros, căptuşit de nouă fibre. Fibrele par să fie asociate separat cu nouă perechi de microtubuli ai axonemei şi se continuă cu coloane la interiorul gâtului piesei

de legătură a spermatidei. Învelişul fibros acoperă axonema de la gât până la începutul piesei terminale. Anulusul migrează distal de această poziŃie, adiacent nucleului de-a lungul cozii până la un punct în care va separa piesa intermediară de piesa principală a cozii. Mitocondriile vor fi strâns împachetate într-un înveliş continuu, de la gât până la annulus. În timpul ultimelor stadii ale spermiogenezei, manşeta dispare şi atunci celulele Sertoli formează din citoplasma care rămâne după alungirea spermatidei, un lob sferoidal denumit corpul rezidual. Acest lob citoplasmatic, care rămâne ataşat la spermatida alungită, printr-o porŃiune îngustă de citoplasmă, este de asemenea interconectată cu alŃi corpi reziduali prin punŃi intercelulare care rezultă din diviziunea incompletă a celulelor germinale pe parcursul spermatocitogenezei. Formarea corpului rezidual completează maturarea finală, iar spermatidele alungite sunt gata pentru a fi puse în libertate sub formă de spermatozoizi. SpermiaŃia Astfel este denumit procesul prin care celulele germinale sunt eliberate în lumenul tubilor seminiferi după spermatogeneză şi spermiogeneză. Celulele astfel puse în libertate sunt considerate a fi spermatozoizi. Celulele Sertoli sunt asociate cu celulele germinale pe parcursul dezvoltării acestora şi s-a evidenŃiat faptul că morfologia lor funcŃională, la unele specii diferă în funcŃie de stadiul de dezvoltare atins de celulele germinale cu care sunt asociate. Rolul celulelor Sertoli în spermatogeneză include suportul şi nutriŃia celulelor germinale, fagocitoza elementelor îmbătrânite precum şi secreŃia lichidelor lumenale. Celulele Leydig au de asemenea un rol în susŃinerea spermatogenezei. Compartimentul celulelor interstiŃiale înconjoară compartimentul tubilor seminiferi pe care îl scaldă într-un lichid bogat în testosteron. În plus, celulele mioide care formează limita epiteliului seminifer, contribuie la mişcările de propulsie ale spermatozoizilor precum şi ale lichidului în tubii seminiferi. Şi celulele mioide, în mod asemănător celulelor Leydig şi Sertoli, sunt afectate de factorii testiculari de creştere. Cercetarea unei secŃiuni histologice transversale prin tubii seminiferi relevă diferite moduri de aranjare, depinzând de tipul celulei germinale, morfologia şi stadiul de dezvoltare a acesteia, precum şi de dispunerea în straturi în lumenul tubilor. În orice zonă a tubului seminifer, pe secŃiune sunt evidente asocieri ale celulelor germinale aparŃinând fiecărui tip. O porŃiune a tubului conŃinând celule de un anume tip este învecinată cu porŃiuni conŃinând celule aflate în stadiile precedente şi imediat următoare celor de referinŃă. Întreaga serie a acestor asocieri este denumită ciclul spermatogen. Intervalul necesar completării unui asemenea ciclu este definit drept durata ciclului spermatogen, reprezentând timpul scurs între două eliberări consecutive de spermatozoizi. Acesta durează 13,8 zile la câine. Un interval mediu de 62 de zile este necesar pentru

spermatogeneză la câine. În literatură nu există informaŃii similare referitoare la motan, dar se presupune că ar fi ceva asemănător. Dispunerea secvenŃială în spaŃiu a celulelor în dezvoltare, pe lungimea tubului seminifer la un moment dat este cunoscută drept valul spermatogen (“spermatogenic wave”). Acest aranjament spaŃial poate servi eliberării constante de spermatozoizi, reducerii congestiei care altfel ar apărea dacă spermiaŃia ar fi simultană pe parcursul lungimii tubului seminifer, iar la modul general facilitează maturarea spermatozoizilor precum şi transportul acestora prin tubi.


CURSUL nr. 6 BARIERA HEMATO – TESTICULARĂ JoncŃiunile celulare Tubii seminiferi nu sunt străbătuŃi de vase de sânge sau limfă. Mai mult, celulele germinale în dezvoltare din interiorul tubilor sunt protejate de modificările chimice ale sângelui printr-o barieră specializată în permeabilitate. Această barieră hemato – testiculară are două componente principale: 1. bariera incompletă sau parŃială a celulelor mioide care înconjoară tubii şi 2. legăturile de tip special dintre celulele Sertoli învecinate. Celulele mioide Membrana bazală sau tunica propria care înconjoară tubii seminiferi conŃine un strat de celule mioide contractile. La unele specii, majoritatea legăturilor intercelulare din acest strat sunt sudate prin alipirea strânsă a membranelor celulare învecinate. Această barieră nu este bine dezvoltată la taur, berbec sau vier, având o importanŃă limitată ca barieră specializată în permeabilitate în testiculele animalelor de fermă. Legăturile dintre celulele Sertoli Principala barieră de permeabilitate dintre sânge şi testicul se consideră a fi complexele situate la joncŃiunile dintre celulele Sertoli învecinate. Aceste joncŃiuni Sertoli – Sertoli, situate chiar lângă baza celulelor, conŃin multiple zone de aderenŃă (legături strânse) în care membranele opuse sunt unite. Aceste joncŃiuni blocante împart tubul seminifer în două compartimente distincte: 1. un compartiment bazal, care conŃine spermatogonii şi spermatocite în preleptoten, şi 2. un compartiment adluminal, conŃinând stadiile mai avansate ale spermatocitelor şi spermatidelor, care comunică liber cu lumenul tubilor. În compartimentul bazal au acces liber componentele care anterior au pătruns prin stratul celulelor mioide. Cea de-a doua barieră, compusă din joncŃiunile blocante, demonstrează un înalt grad de permeabilitate, de la completa excludere a unor substanŃe până la aproape liberul transfer al altora. Permeabilitatea diferenŃiată pare a fi importantă în menŃinerea unui mediu potrivit pentru funcŃia spermatogenă a tubilor. Bariera H-T nu doar exclude pătrunderea unor anumite substanŃe dar şi funcŃionează prin păstrarea unor niveluri specifice ale anumitor substanŃe, precum ABP, inhibina şi inhibitori ai enzimelor. ANTIGENITATEA SPERMATOZOIZILOR O funcŃie importantă a barierei hemato –testiculare este izolarea imunologică a gameŃilor în dezvoltare. ImportanŃa sa rezidă în faptul că spermatocitele, spermatidele şi spermatozoizii sunt aproape percepute ca celule străine de către sistemul imun al masculului adult. Deci, sechestrarea celulelor germinale în dezvoltare în spatele unei bariere imunologice previne formarea anticorpilor împotriva propriilor celule spermatice în organismul masculului adult.

AUTOIMUNITATEA Imunizarea unui mascul împotriva SPE sau a unor antigeni spermatici izolaŃi determină diferite grade de orhite autoimune precum şi întreruperea spermatogenezei. Leziunile barierei H-T sau ale porŃiunii epididimale a canalului deferent (traumatisme sau infecŃii) adesea generează orhite autoimune care afectează ambele testicule. Şi vazectomia poate genera orhită autoimună. Gravitatea acesteia depinde de specie precum şi de intervalul postoperator. În acest caz se presupune că răspunsul autoimun apare datorită destinderii intermitente şi rupturii căilor ligaturate ceea ce va genera eliberarea SPE în cavitatea peritoneală. Ca rezultat al autoimunizării, concentraŃia Ac antiSPE din lichidul seminal poate fi crescută. Ac sunt transportaŃi în spermă din plasma sanguină precum şi în secreŃia veziculelor seminale şi a prostatei.. Aceşti Ac nu pot pătrunde în tubii seminiferi datorită barierei H-T. Drept urmare, masculi cu tubii seminiferi normali dpdv histologic pot fi infertili consecutiv prezenŃei Ac în lichidul seminal. Spermatozoizii care cuplează Ac pe suprafaŃa lor pot suferi o modificare a motilităŃii precum şi imposibilitatea de a pătrunde prin mucusul cervical. Anticorpii antispermatici pot determina aglutinarea SPE şi formarea unor coaguli mari. Ac direcŃionaŃi împotriva SPE pot influenŃa în mod evident fertilitatea masculului. Aceşti Ac pot fi detectaŃi cu ajutorul imunofluorescenŃei, cu antiglobuline radiomarcate sau prin metodele care recurg la imobilizarea SPE sau la aglutinarea lor. Anticorpii antispermatici interferează funcŃiile SPE prin mai multe căi: 1. Ac pot interfera diferite procese interactive dintre celule, inclusiv capacitarea şi hiperactivarea spermatozoizilor, ataşarea SPE, reacŃia acrozomului şi pătrunderea prin ZP; 2. Ac cuplaŃi pe suprafaŃa SPE pot inhiba supravieŃuirea şi pătrunderea prin mucusul cervical; 3. Autoanticorpii antispermatozoizi pot interfera spermatogeneza. Cantitatea imunoglobulinelor cuplate la spermatozoizii ejaculaŃi depinde de câteva mecanisme: 1. ConcentraŃia Ac antispermatici în secreŃiile glandelor accesorii ale masculului; 2. ProducŃia locală a Ac comparativ cu cea care transsudează din sânge; 3. Cuplarea Ac la SPE în epididim înaintea ejaculării, comparativ cu cuplarea care apare atunci când spermatozoizii sunt amestecaŃi cu lichidul seminal; 4. Timpul scurs de la ultima ejaculare; 5. Afinitatea Ac faŃă de suprafaŃa SPE. PATOLOGIA APARATULUI GENITAL MASCUL AfecŃiunile testiculare Hipoplazia testiculară stare patologică congenitală care se manifestă la pubertate este necesară diferenŃierea faŃă de atrofie şi testiculele reduse în dimensiuni la apariŃia hipoplaziei testiculare contribuie factorii de mediu, rasa, anomaliile citogenetice, caracteristicile de intersexualitate şi criptorhidismul importantă la tauri

diagnosticul nu se stabileşte doar pe baza dimensiunilor testiculare se iau în considerare şi caracteristicile spermei, structura histologică a testiculului precum şi datele anamnetice dpdv microscopic, hipoplazia testiculară variază de la parŃială la difuză, putând fi unisau bilaterală în cazurile grave, tubii seminiferi sunt reduşi în dimensiuni, marcaŃi doar de celulele Sertoli, prezentând o membrană bazală îngroşată Criptorhidia Testiculul nu coboară în scrot. DehiscenŃa presupune migrarea tansabdominală (independentă de androgeni) şi coborârea ingvino-scrotală (dependentă de androgeni), influenŃată de nervul genitofemural şi gubernaculum în mod obişnuit exprimare unilaterală, fiind frecvent întâlnită la vieri şi armăsari asociată cu hipoplazia testiculară asociat criptorhidiei, se pot evidenŃia: disgeneză cromozomială, lipsa androgenilor, a GnRH, gubernaculum incomplet dezvoltat DegenerescenŃa testiculară cauză majoră a infertilităŃii la masculii tuturor speciilor frecvenŃa creşte pe măsura îmbătrânirii cauze: temperaturile extreme, infecŃiile sistemice, factori nutriŃionali, toxine, deficienŃe hormonale şi excese, ocluzii vasculare, obstrucŃii ale fluxului spermatic, autoimunitatea şi vârsta degenerescenŃa testiculară progresează de la atrofie la stadiul de fibroză (colapsul tubilor seminiferi) inflamaŃia imuno-mediată a Ńesutului interstiŃial (antigeni intratubulari traversează bariera H-T) Procesele inflamatorii orhitele pot debuta ca periorhite cu reacŃie inflamatorie a tunicii vaginale care implică gradat şi testiculele o peritonită anterioară poate reprezenta cauza obişnuită a orhitei, având în vedere legătura dintre peritoneu şi straturile tunicii vaginale, prin intermediul inelului ingvinal cale ascendentă (hematogenă) - traumatisme, bacterii (Brucella sp.), saprofiŃi ai căilor genito-urinare (Actinomyces, E.coli, Haemophilus spp) unisau bilaterală; inflamaŃia unui testicul poate produce modificări termice la testiculul contralateral) Tumorile testiculare descrise la câini, armăsari şi tauri tumori gonado-stromale (ale celulelor Leydig şi Sertoli) tumori ale celulelor germinative (seminoame şi teratoame) seminoamele exprimă un potenŃial malignizant la armăsari la câine, tipul tumorii poate fi relativ uşor diagnosticat pe baza aspectului macroscopic al secŃiunii

Biopsia testiculară poate fi utilizată complementar examenului spermei pentru a determina cauza infertilităŃii exceptând taurul, unde tunica albugineea este bogat vascularizată, se poate uşor preleva Ńesut testicular se recomandă tehnica transcutanată aseptică, pentru a reduce riscul infecŃiilor Examenul spermei calitatea spermei se apreciază pe baza volumului ejaculatului, concentraŃiei spermatozoizilor, mobilităŃii şi caracteristicilor morfologice ale acestora circumferinŃa scrotală (tauri) intensitatea libidoului şi a disponibilităŃii pentru împerechere Glandele anexe controlul androgenilor maturarea spermatozoizilor se desăvârşeşte în plasma seminală, sub influenŃa factorilor constituenŃi ai acesteia taur: disfuncŃii ale glandelor accesorii (în special ale epididimului) pot genera anumite anomalii ale spermatozoizilor epididimita berbecilor (Brucella ovis - coada epididimului, extinzându-se şi la alte porŃiuni; Hemophilus agni sau Actinobacillus seminis determină inflamaŃia capului epididimar la berbecii tineri) seminoveziculita (adenita veziculelor seminale) taurilor generată de: Brucella, Actimomyces pyogenes, Chlamydia spp., Mycoplasma spp., Ureaplasma diversum, Hemophilus somnus, Streptococci, Staphylococci AfecŃiunile penisului hematomul - ruptura corpului cavernos sau a tunicii albugineea (intromisiune sau mişcări copulatorii - rasele grele de tauri) habronemiaza (Habronema spp) se dezvoltă în procesul uretral al penisului cailor, generând o inflamaŃie semnificativă a prepuŃului şi penisului balanita şi postita; atât penisul cât şi prepuŃul se inflamează consecutiv acŃiunii bacteriilor şi virusurilor; de obicei apare balano-postita neoplaziile peniene fibropapilomul; la taur, virus papilloma; produce durere, animalele afectate refuzând monta carcinomul celulelor scvamoase; apare la armăsari, având aspect ulcerativ, conopidiform, localizat pe gland sau prepuŃ tumorile veneriene transmisibile; apar la câine, tumorile prezentând un cariotip constant de 59 de cromozomi somatici (faŃă de cei 78 prezenŃi în mod normal la câine)

INFERTILITATEA MASCULULUI Anamneza • boli de tinereŃe (traumatisme torsionări)

•

pubertate: - precoce (sindrom adreno-genital) - tardivă (sindrom Klinefelter sau hipopgonadism idiopatic) • expunerea prenatală la DES sporeşte incidenŃa chiştilor epididimari şi a frecvenŃei criptorhidismului expunerea la substanŃe toxice, căldură, radiaŃii chimioterapia exercită un efect dependent de doză, exercitând o influenŃă devastatoare asupra epiteliului germinal steroizi anabolizanŃi, cimetidina, spironolactona afectează ciclul reproductiv sulfasalazina, nitrofurantoina afectează motilitatea spermatozoizilor tratamente anterioare ale afecŃiunilor interne sau chirurgicale pot compromite temporar funcŃia de reproducere monorhizii - caractersitici modificate ale spermei rezolvarea herniilor testiculare poate afecta canalul deferent şi vascularizaŃia testiculului orice stare febrilă dereglează spermatogeneza; caracteristicile ejaculatului pot fi afectate 2-3 luni după eveniment afecŃiuni renale, ale tiroidei, ficatului, influenŃează fertilitatea şi chiar parametrii hormonali Examenul clinic semne de hipogonadism (caractere sexuale slab dezvoltate, penis, testicule, prostată, scrot subdezvoltate, masă musculară subdezvoltată) testicule: dacă tubii seminiferi au fost afectaŃi înaintea pubertăŃii, testiculele sunt mici şi tari; dacă au fost afectaŃi post puberal, sunt mici şi moi neregularităŃi ale epididimului sugerează o fostă infecŃie şi o posibilă obstrucŃie prostată mică (deficienŃă de androgeni) sau mărită (infecŃie) anomaliile penisului - hipospadias, curbare anormală şi fimoză palparea scrotului (evidenŃierea varicocelului) şi a canalelor deferente (2% dintre bărbaŃii infertili evidenŃiază absenŃa congenitală a canalelor deferente şi a veziculelor seminale) Cauze pre-testiculare deficienŃa secreŃiei de gonadotropin releasing factors hiposecreŃie de FSH, LH insuficienŃă hipofizară (tumori, procese infiltrative, intervenŃii chirurgicale, radiaŃii) hiperprolactinemie hemocromatoză (bărbat) tulburări endocrine (exces de estrogeni-androgeni, glucocorticoizi, hiper- şi hipotiroidism Cauze testiculare anomalii cromozomiale (Klinefelter, XYY) distrofie miotonă anorhie bilaterală aplazia celulelor germinale (Sertoli-cell-only syndrome) gonadotoxine (medicamente, radiaŃii) orhite traumatisme

afecŃiuni sistemice (renale, hepatice) tulburări ale sintezei ANDR sau acŃiunii acestora criptorhidie varicocel Cauze post-testiculare tulburări ale transportului spermei (congenitale, dobândite sau funcŃionale) tulburări ale motilităŃii sau funcŃiilor SPE • defecte congenitale ale cozii SPE • defecte de maturare • afecŃiuni imunologice • infecŃii tulburări ale funcŃiei sexuale Diagnosticul infertilităŃii biopsia şi radiografia testiculară evaluarea spermei evaluarea statusului hormonal (FSH, LH, LTH) studierea cromozomilor investigaŃii imunologice testări speciale ale SPE: interacŃiunea SPE-mucus cervical, evaluarea acrozomului, testul hipo-osmotic Tratamentul infertilităŃii varicocelectomia ablaŃia adenoamelor hipofizare terapie hormonală de substituŃie terapia infertilităŃii de natură imunologică tehnicile de reproducere asistată


CURSUL nr. 7 Endocrine Disruptors to disrupt = a distruge, a sfărâma, a dezmembra, a submina, a dizloca, a sparge Rachel Carson - 1962 - Silent Spring Theo Colborn, Diane Dumanovski and John Peterson Myers - 1996, Dutton Press - Our Stolen Future: Are We Threatening Our Fertility, Intelligence and Survival ? Sheldon Krimsky – 2000 – Hormonal Chaos : The Scientific and Social Origins of the Environmental Endocrine Hypothesis. John Hopkins University Press, Baltimore, MD

SISTEMUL ENDOCRIN Sistemul endocrin acŃionează ca un sistem de mesaje chimice care asigură comunicarea în întregul organism. Asigură controlul şi reglarea funcŃiilor organismului, în mod special a creşterii şi dezvoltării Hormonii - în concentraŃii mici induc efecte semnificative - generaŃi de creier, tiroidă, gonade şi alte glande endocrine, eliberaŃi în fluxul sanguin care îi poartă la organele - Ńintă, unde activează şi reglează anumite funcŃii Sistemul este dirijat de la nivelul hipofizei, care acŃionează ca un centru de control, indicând ovarelor sau tiroidei când şi câŃi hormoni să producă şi să elibereze - hipofiza este în acord fin cu hipotalamusul, care acŃionează ca un termostat, solicitând hipofiza să intensifice producŃia, să o diminueze sau să o suprime Toate aceste mesaje induc câte un feed-back, menŃinând toate componentele organismului în funcŃiune şi acŃionând ca un întreg De asemenea, hormonii ghidează dezvoltarea sistemului nervos şi al celui imunitar al copilului În acelaşi timp, hormonii programează funcŃionarea corespunzătoare a organelor şi Ńesuturilor precum ficat, rinichi, musculatură; aceste procese de reglare sunt cruciale în perioada timpurie de dezvoltare a copilului Hormonii tirodieni sunt esenŃiali pentru funcŃia neurologică normală, deficienŃele acestor hormoni pe parcursul perioadei fetale sau copilăriei ducând la retardare mentală, pierderea auzului şi probleme logopedice Chiar în cazul unui IQ normal, copii care au suferit deficienŃe ale hormonilor tiroidieni sunt predispuşi la probleme de înŃelegere a limbajului, dificultăŃi de învăŃare şi memorizare, precum şi comportament hiperactiv

SUBSTANłELE CHIMICE INTERFEREAZĂ ACESTE SISTEME ESENłIALE DE REGLARE Endocrine Disruptor = orice substanŃă exogenă care generează efecte adverse asupra sănătăŃii unui organism integru, sau asupra descendenŃilor acestuia, consecutiv modificărilor induse în funcŃia endocrină Endocrine Disruptor = orice substanŃă care poate interfera funcŃia hormonală normală majoritatea sunt substanŃe sintetice, liposolubile, reprezentate de pesticide sau chimicale de uz industrial • pesticidele includ compuşi cloruraŃi (DDT), toxafen şi keponă • compuşii industriali includ PCB (bifenoli policloruraŃi), fenoli şi dioxine • caracteristicile comune sunt reprezentate de persistenŃa îndelungată în mediu şi organisme, fiind mai degrabă liposolubile, decât hidrosolubile Hormono-mimetice substanŃe chimice care acŃionează în organism ca şi hormonii normali DES (dietilstilbestrol), administrat în anii `50 şi `60 pentru a preveni avorturile la femei fiicele mamelor tratate cu DES au manifestat o incidenŃă crescută a unei forme rare de cancer şi a endometriozei fii mamelor tratate cu DES au înregistrat o frecvenŃă crescută a criptorhidiei, hipospadiasului, iar ca adulŃi, oligospermie Hormono-blocante interferează funcŃionarea naturală a hormonilor substanŃele blocante se cuplează la aceiaşi receptori proteici ca hormonii, fără a stimula însă vreo acŃiune aceste substanŃe doar blochează calea hormonilor, împiedicându-i să-şi transmită mesajele DDE (metabolit al DDT) a blocat acŃiunea TEST, conducând la apariŃia penisurilor subdimensionate la aligatorii din Lake Apopka, Florida Hormono-declanşatoare substanŃe chimice care interferează prin cuplarea la receptorii proteici, dar mai apoi declanşează un răspuns anormal în celulă aceste substanŃe declanşatoare generează creşterea la momentul nepotrivit, modificări ale metabolismului sau sinteza unor produşi diferiŃi dioxina şi derivaŃii săi dioxina acŃionează printr-un proces asemănător celui declanşat de un hormon, generând însă răspunsuri complet noi AcŃiuni demonstrate ale EDs La masculii animalelor de laborator, expunerea la Eds a determinat influenŃarea factorilor TGF = transforming growth factor şi NT3 = neurotropin de creştere produşi la nivel local (T family of factors), cu acŃiune paracrină asupra creşterii şi dezvoltării testiculare. Studiile au demonstrat că factorii din mediu, exercitând acŃiune de tip estrogenic (ex. metoxiclor) sau anti-androgenică (ex. vinclozolina) afectează fertilitatea masculilor perturbând acŃiunea neurotropinelor sau a factorilor de creştere. Mai mult, a fost

evidenŃiat efectul metoxiclorului asupra generaŃiei F1. Mamele expuse au generat masculi afectaŃi de o funcŃie spermatogenică scăzută şi de un grad ridicat al apoptozei spermatozoizilor. Femelele de hamster supuse acŃiunii DES (dietilstilbestrol) sau 17β estradiolului, au demonstrat la nivelul uterului o activitate hiperplazică intensificată şi un nivel ridicat al apoptozei. Studiul a dovedit că DES este un EDs perinatal mai activ decât E2. Expunerea perinatală la estrogeni a generat un “estru persistent”, caracterizat prin lipsa ovulaŃiei şi ovare chistice care au secretat cantităŃi mari de E2, şi puŃin sau deloc P4. Fenomenul răspunsului estrogenic deviant la nivelul uterului femelelor de hamster expuse perinatal la DES include atât amplificarea creşterii celulare cât şi apoptoza celulelor epiteliale endometriale, procesul fiind generat de dezechilibrul exprimării anumitor oncogene implicate în controlul proliferării celulare. EExxppuunneerreeaa iinn uutteerroo la dioxine, PCBs şi DDT a generat organisme animale cu fertilitate redusă, anomalii neurologice şi alte deficienŃe. Contaminarea cu EDs • contaminarea primară cu EDs (dioxină, PCBs) are loc prin intermediul hranei (în special carne şi peşte contaminate cu niveluri scăzute ale acestor chimicale) • peştele care provine din regiuni puternic contaminate poate purta în grăsimea sa concentraŃii superioare celor evidenŃiate în carnea de vită, porc sau pui • sursa contaminării o reprezintă arderea deşeurilor clorurate, scăpările din procesele industriale sau pesticidele care ajung accidental în rezervele de hrană • chimicalele de uz industrial ajung în hrană din emisiile în aer sau atunci când resturile deversate în mediu sunt ingerate de peşti, vite, porci, pui sau alte animale domestice • emisiile de gaze de la crematoare sau alte procese de ardere (dioxină, PCBs) • pesticide aplicate pe recolte, care rămân pe acestea sau ajung în hrană • apă potabilă contaminată cu EDs sau provenită din scurgeri din recipiente de plastic heringi care formează perechi de acelaşi sex şi abandonează ouăle vulturi care nu mai manifestă comportamentul de clocire şi-şi neglijează puii scăderea dramatică a populaŃiilor de vidre cocoşi feminizaŃi miei născuŃi orbi scăderea populaŃiei de urşi albi delfinii eşuaŃi şi focile moarte pe coastele Atlanticului, Mediteranei contaminarea cu EDs poate genera fenomene asemănătoare celor declanşate de steroizii sexuali, afectând negativ sănătatea şi capacitatea reproductivă a organismelor expunerea la EDs poate contribui la declanşarea cancerelor hormono-dependente (de sân, prostată sau testiculare), a tulburărilor funcŃiei de reproducere la masculi, în mod special prin scăderea numărului spermatozoizilor din ejaculat şi a volumului acestuia se consideră că aceste efecte sunt mediate prin intermediul proteinelor specifice cunoscute drept RECEPTORII PENTRU ESTROGENI, ANDROGENI, HORMONI TIROIDIENI ŞI DIOXINĂ

eeffeeccttuull d doozzeelloorr ssccăăzzuuttee 1997: Whelshons et al. Este necesar ca DOAR o mică proporŃie (5-10%) a receptorilor să fie ocupaŃi pentru a induce un răspuns. Nagel et al (1997) au arătat că 2 ppb de BISFENOL A administrate şoricioaicelor gestante sunt suficiente pentru a induce hipertrofia prostatei la descendenŃi. Doza era de 25.000 mai mică decât cea de 50 mg/kg, recunoscută drept NOAEL (No Observed Adverse Effects Level) 1997: Colerangle and Roy au arătat că o doză de BISFENOL A de 30 de ori mai mică decât cea stabilită de Comunitatea Europeană a determinat un efect profund asupra activităŃii proliferative a glandei mamare la şobolan 1998: Vom Saal şi col. consideră că datele anterioare sugerează că o tulburare a dezvoltării organelor reproductive fetale ar putea surveni în cazul în care mama însărcinată consumă zilnic, timp de o săptămână, cantităŃile de BISFENOL A care se găsesc în mod oobbiişşnnuuiitt în conserve sau produse alimentare încălzite în recipienŃi de policarbonat. Evidence of Reproductive Endocrine Effects in Women with Occupational Fuel and Solvent Exposures. Susan R. Reutman et al. Environmental Health Perspectives 2002; 110:805-811 Hidrocarburile (HC) din combustibili şi solvenŃi 63 femei din U.S. Air Force: aerul expirat, urină toluenul şi benzenul - cele mai frecvent izolate în aerul expirat femeile cu cea mai ridicată expunere la HC au avut cele mai scăzute niveluri ale LH se presupune că unii compuşi ai combustibililor şi solvenŃilor acŃionează ca destabilizatori endocrini Semen quality and reproductive endocrine function in relation to biomarkers of lead, cadmium, zinc and copper in men. Telisman S et al. Environmental Health Perspective 2000; 108:45-53 149 muncitori sănătoşi care lucrau cu plumb Lucrătorii cu Pb: densitate şi motilitate scăzută, % crescut de SPE anormali, E2 crescut Cd corelat pozitiv cu % SPE anormali, nivelurile crescute ale LH şi TEST şi LTH scăzută Pb şi Cd acŃionează asupra testiculelor inducând o deficienŃă relativă de Zn sau interferând distribuŃia acestuia Zn indispensabil producerii, maturării şi viabilităŃii SPE Testicular cancer and occupational exposures with a focus on xenoestrogens in polyvinyl chloride plastics. Ohlson CG, Hardell L. Chemosphere 2000; 40:1277-1282 cancerul testicular şi activitatea în fabricarea PVC de 6x mai mulŃi bărbaŃi cu seminom, între cei care au lucrat în industria PVC-ului substanŃele de înmuiere pe bază de ftalaŃi, utilizate în fabricarea PVC, au fost identificate ca având toxicitate testiculară şi acŃiune endocrin destabilizatoare la animale The PBDEs: An emerging environmental challenge and another reason for breast-milk monitoring programs. Hooper K., McDonald TA. Environmental Health Perspective 2000; 108:387-392

PBDEs (polybrominated diphenyl ethers) sunt reziduuri prezente în mase plastice, spume şi textile. Nefiind legate la produsele plastice, sunt eliberate în timp, contaminând mediul interior şi cel exterior PBDEs par a fi carcinogene, EDs şi toxice pentru dezvoltarea sistemului neuronal PBDEs au fost asociate cu limfomul ne-Hodgkin la om, cancere la rozătoare şi dezechilibrarea homeostaziei hormonilor tiroidieni Endocrine Disruptors Block Sperm Function. Fraser R.L et al., Global Pesticide Campaigner (Volume 12, Number 2), August 2002. Spermatozoizii expuşi la acŃiunea EDs se maturează prea rapid şi ratează întâlnirea cu ovocita, sau dacă ajung, nu o mai pot fecunda. Cercetătorii au arătat că suspensionarea spermatozoizilor de şoarece în soluŃii cu concentraŃii scăzute de EDs (care acŃionează ca pseudo-estrogeni) s-a caracterizat prin maturare foarte rapidă şi eliberarea prematură a enzimelor necesare pătrunderii prin ZP. Între produsele testate s-au aflat şi ftalaŃii, substanŃe chimice de tip EDs, utilizate ca agenŃi de înmuiere pentru multe produse din mase plastice (chiar şi instrumentar medical), deodoranŃi, loŃiuni sau lacuri de unghii. PROBLEME: 1. Toate organismele păsărilor, animalelor şi oamenilor contemporani au fost EXPUSE. 2. Experimentele pe animale de laborator au demonstrat că expunerea la EDs are impact la doze mult mai scăzute decât cele care au putut fi imaginate pentru a fi luate în considerare. 3. Mult mai multe căi şi sisteme guvernate de către hormoni – poate chiar TOATE sistemele mediate de mesaje chimice sunt actualmente considerate a fi vulnerabile la acŃiunea EDs. 4. Tot mai mulŃi compuşi chimic se dovedesc a avea acŃiune de tip EDs. 5. Sfera efectelor asupra sănătăŃii omului a fost lărgită prin luarea în considerare a efectelor expunerii organismului adult asupra dezvoltării din perioada intrauterină 6. Metodele toxicologice tradiŃionale, de evidenŃiere a curbei doză-efect, s-au dovedit ineficace pentru studierea EDs.

Analogie funcŃională între semnalizarea endocrină realizată de E2 şi cea simbiotică realizată de luteolină (flavonă). SUS: ovarul secretă 17β E2, molecula de semnal care activează aparatul transcripŃional controlat de ER (receptorii ptr E2), în asociere cu un fragment specific de ADN (ERE – estrogen response element), acŃiunea desfăşurându-se în celula Ńintă pentru E2 (de ex. celula uterină). JOS: rădăcina lucernei secretă luteolina în solul înconjurător. Aceasta constituie semnalul care activează aparatul transcripŃional controlat de proteina de cuplare pentru NodD şi fragmentul de ADN răspunzător de recunoaştere, conŃinut în regiunea promotoare a genei Ńintă. Asocierea luteolină-NodD activează transcripŃia mai multor gene bacteriene responsabile de „nodulaŃia” realizată în rădăcina plantelor. În nodulaŃie se vor adăposti bacteriile furnizoare de azot (simbioză).


CURSUL nr. 8 CONTRACEPłIA Controlul funcŃiei de reproducere la căŃea • metode chirurgicale (ovariectomia, ovariohisterectomia, ligatura oviductelor) • metode hormonale (estrogeni, progestageni) • metode imunologice (imunizări pasive sau active) Ovarian Remnant Syndrome prezenŃa estrului în primul an consecutiv OVARIECTOMIEI (până la 3 ani post operator) Ńesutul ovarian care rămâne consecutiv unei ovariectomii incomplete se chistizează şi poate cauza manifestările specifice estrului stump pyometra (piometrul bontului uterin) – la 20% dintre femelele ovariectomizate (Okkens şi col., 1981) ; la 58-71% dintre femelele cu piometru, este prezent şi Ńesut ovarian funcŃional frotiul vaginal indică prezenŃa E2, şi a Ńesutului ovarian (sau are aspect tipic anestrului, la femelele castrate BINE) la animalele de companie NU se admite că suprarenalele pot produce suficient estrogen pentru a genera estrul nivelul crescut al LH arată că femela a fost castrată (lipseşte inhibiŃia exercitată de ovare) determinări hormonale (P4 şi E2) trei săptămâni consecutiv (2 X săpt) ; P4 peste 1 ng/ml sau E2 peste 40 pg/ml indică prezenŃa Ńesutului ovarian DD faŃă de vaginite, infecŃii are tractului urinar, estrogeni exogeni Structura analogilor diferă de cea a hormonilor naturali • legătura dintre hormonii naturali şi receptorii acestora este tranzitorie • analogii hormonali nu sunt întotdeauna uşor inactivaŃi iar fixarea lor pe proteinele sanguine de transport sau pe receptorii Ńesuturilor Ńintă se poate prelungi pe o perioadă anormală • fixarea analogilor hormonali pe proteinele sanguine de transport al hormonilor naturali poate afecta grav echilibrul hormonal Principalele efecte cunoscute ale analogilor hormonali • corticoizii • progestagenele • estrogenii • androgenii

•

analogi ai GnRH

Deşi sunt insuficient caracterizate efectele iatrogene ale analogilor hormonali, au fost evidenŃiate câteva efecte certe asupra funcŃiei de reproducere. Corticoizii Reprezintă medicamente mult prea uşor utilizate în medicina veterinară, având avantajul de a induce rapid o ameliorare spectaculoasă a stării animalului. Din păcate, pe termen mediu sau lung, pot apărea grave efecte secundare care compromit notabil funcŃia de reproducere. În practică, la femele, anestrul se prelungeşte anormal. La masculi, chiar dacă în general libidoul se păstrează, adesea se constată o scădere a volumului ejaculatului, numărul şi mobilitatea spermatozoizilor fiind considerabil diminuate. Repercusiunile corticoterapiei asupra funcŃiei de reproducŃie se datorează combinaŃiei exercitate de câteva dintre efectele acesteia asupra echilibrului neurohormonal: InhibiŃia directă a câtorva etape ale steroidogenezei gonadale, precum ar fi transformarea colesterolului în androgeni şi aromatizarea estradiolului; CompetiŃia cu progesteronul la nivelul situsurilor de fixare pe CBG (Cortisol Binding Globulin), proteinele lor comune de transport sanguin. Corticoizii provoacă o eliberare anormală de progesteron şi în mod indirect, întreŃin o inhibiŃie centrală a activităŃii gonadale. AcŃiunea inhibitoare asupra funcŃiei tiroidiene care contribuie de asemenea la activitatea gonadală: sistemul nervos central reacŃionează la efectele corticoizilor prin frânarea activităŃii tiroidiene. Hipotiroxinemia stimulează secreŃia prolactinei, ea însăşi inhibitoare a steroidogenezei la nivelul transformării colesterolului în progesteron. Acest ultim efect poate contribui la ginecomastie. Pe termen mediu, corticoizii provoacă inhibarea producŃiei suprarenale, iar cortizolul este indispensabil activităŃii gonadale: pertubarea steroidogenezei conduce la o producŃie anormală de estradiol care provoacă atât la masculi cât şi la femele hipogonadism, iar la femele, în mod curios nu se observă nici o manifestare estrală iar anestrul indus de către corticoizi se poate prelungi timp de câteva luni. La masculi, este posibil ca hiperestradiolemia şi hipotestosteronemia induse de către corticoizi să activeze producerea inhibinei de către celulele Sertoli. Această cibernină anti-FSH perturbă steroidogeneza. Administrarea corticoizilor unei femele gestante poate provoca un avort prin suferinŃă fetală sau o parturiŃie prematură. La naştere, micuŃii pot prezenta o atrofie corticosuprarenală care creşte riscul mortalităŃii neonatale. De asemenea, trebuie reamintit că administrarea corticoizilor pe parcursul gestaŃiei creşte frecvenŃa tarelor ereditare. Efectele secundare ale corticoizilor nu sunt generate nici de forma farmacologică, nici de posologie.

Progestagenele Utilizarea progestagenelor este de asemenea foarte răspândită, acestea fiind folosite în vederea contracepŃiei la căŃea sau pentru anumite efecte cutanate la specia felină. În plus faŃă de activitatea lor antiestrogenică, progestagenele acŃionează şi la nivel central inducând perturbaŃii neurohormonale şi metabolice care mimează un anabolism de gestaŃie. Se observă efecte variabile, în funcŃie de individ, cel mai adesea regăsindu-se o hiperreactivitate corticosuprarenală, o hiperinsulinemie (cu riscul diabetic consecutiv), o hipersecreŃie de hormon de creştere (care poate conduce la acromegalie cu producŃie anormală de Ńesut conjunctiv), o hipotiroidie şi un efect natriuretic. Astfel, insulina este recunoscută drept hormon activ în zona hipotalamică, influenŃând eliberarea GnRH şi a LH. De asemenea, insulina reprezintă un factor care influenŃează activitatea ovariană prin inducerea receptorilor pentru LH în granuloasă, contribuind prin aceasta la modularea ovulaŃiei. Factorii de creştere asemănători insulinei (IGFs – Insulin-like Growth Factors) reprezintă mediatori importanŃi ai creşterii, lactaŃiei şi reproducŃiei. În cadrul acestei familii de citokine, IGF1 joacă un rol important. Astfel, IGF1 este un mitogen puternic pentru celulele epiteliale mamare, putând influenŃa şi apoptoza acestui tip de celule. De asemenea, IGF1 poate fi un puternic stimulator al steroidogenezei în granuloasă precum şi în celulele luteale. Roberts şi col. (1997) au arătat că sistemul IGF poate regla funcŃia hipotalamo-hipofizară şi că ansamblul hipofizar al IGF1 poate fi reglat de către hormonii ovarieni şi hipotalamici. Drept urmare, componentele circulante sau local produse ale sistemului IGF pot asigura un mecanism prin care modificările în statusul metabolic al animalelor pot fi percepute la nivelul axului hipotalamohipofizo-ovarian în vederea reglării funcŃiei de reproducŃie. GH (hormonul de creştere) este cunoscut şi drept hormonul somatotrop (STH), datorită efectului său stimulator asupra celulelor organismului. STH acŃionează şi asupra tiroidei. Efectele sale includ: intensificarea sintezei proteice în toate celulele organismului; intensificarea mobilizării acizilor graşi din grăsimi precum şi intensificarea utilizării acizilor graşi în vederea producerii energiei; scăderea gradului de preluare a glucozei din organism. La femelele gestante s-a încercat în numeroase ocazii suplimentarea secreŃiei gonadale prin administrarea progestagenelor. Acest tratament trebuie utilizat cu multă precauŃie. Trebuie să ne asigurăm că avem de-a face într-adevăr cu o hipoprogesteronemie şi că avortul este inevitabil. De fapt, progestagenele pot nu doar să perturbe interrelaŃiile naturale existente între corpul luteal – unitatea fetoplacentară – hipotalamus/hipofiză, ci şi să acŃioneze asupra dezvoltării fetale şi să inducă malformaŃii osoase sau anomalii ale organelor reproductive (intersexualitate, hipertrofie clitoridiană). Progestagenele pot în egală măsură să inducă şi o eliberare excesivă de cortizol (prin competiŃia de cuplare la nivelul CBG), care provoacă imediat o hipercortizolemie (risc de avort, de inhibiŃie gonadală, tulburări ale metabolismului general) iar secundar, induc o inhibare a axului corticosuprarenal care poate sta la baza unui hipocortizolism, iar apoi, a unui hipogonadism.

Estrogenii Câinele are reputaŃia uneia dintre cele mai sensibile specii la estrogeni, datorită gravelor aplazii medulare iatrogene puse în evidenŃă consecutiv administrării acestora. Se cunosc destul de puŃine asupra efectelor pe termen mediu şi lung exercitate asupra reproducătorilor (iar la specia felină, aceste aspecte sunt şi mai puŃin cunoscute). Estrogenii sunt prin excelenŃă antiandrogeni (prin diminuarea sintezei şi acŃiunii acestora). Este nerecomandabilă aplicarea unor asemenea tratamente pentru limitarea temporară a libidoului la animalele destinate reproducŃiei. În fapt, chiar dacă câinelui îi revine rapid libidoul la normal, spermatogeneza poate fi grav perturbată timp de 5 – 10 luni. În plus, estrogenii pot avea consecinŃe negative asupra aspectului pielii, cu consecinŃe nefaste asupra expoziŃiilor sau a alegerii reproducătorilor. La femele, se pare că avorturile induse cu ajutorul estrogenilor nu provoacă grave tulburări hormonale pe termen mediu. Din păcate, funcŃia reproductivă este adesea compromisă prin efectele directe ale estrogenilor asupra organelor genitale, soldate cu metrite sau piometru. De aceea este preferabil să nu se utilizeze estrogenii pentru tratamentul galactoreei care însoŃeşte pseudogestaŃia, ci să se prefere analogii dopaminei (care diminuează secreŃia prolactinei), deoarece estrogenii induc în câteva zile sinteza prolactinei şi a receptorilor săi mamari. Ca atare, lactaŃia nu este total blocată ci se re-declanşează mult mai puternic. Reproducătorii sunt practic expuşi riscurilor administrărilor repetate şi prelungite de estrogeni, chiar dacă aceste tratamente sunt destinate acestor animale excluse de la reproducŃie tocmai datorită problemelor lor (probleme cutanate, incontinenŃă urinară, “circumanaloame” sau tulburări ale prostatei). La carnivorele domestice, riscul neoplaziilor induse prin administrarea estro- progestativelor este puŃin cunoscut, deoarece anchetele epidemiologice sunt dificil de realizat şi carnivorele nu pot fi utilizate modele animale în cancerologie. Dar cunoştinŃele acumulate la alte specii precum şi evidenŃierea receptorilor specifici în anumite tumori mamare canine, permite supoziŃia conform căreia tratamentele cu analogi steroidieni sunt susceptibile de a favoriza procesele tumorale. Androgenii În ultimii câŃiva ani androgenii sunt foarte folosiŃi drept anabolizanŃi care facilitează creşterea animalelor ameliorând şi performanŃele câinilor de sport. În scurt timp se constată grave tulburări secundare: hipogonadism (absenŃa ciclului la femele, azospermia la mascul), oprirea bruscă a creşterii prin calcificarea precoce a cartilajelor de conjugare, naşterea unor descendenŃi intersexuaŃi.

Analogi ai GnRH Încercarea de a induce ovulaŃia prin intermediul analogilor GnRH s-a dovedit puŃin mulŃumitoare la carnivorele domestice. Deşi s-au obŃinut unele rezultate, nu s-a impus nici un protocol. Studiile au relevat faptul că nu atât cantitatea secretată cât ritmul de secreŃie controlează funcŃia de reproducere: creşterea, apoi descreşterea ritmului de secreŃie a GnRH induce hipogonadism. Insuficienta cunoaştere a acestui subiect rămâne larg întâlnită în cazul carnivorelor mici şi trebuie subliniat faptul că administrarea intempestivă a analogilor GnRH poate genera efecte inverse celor scontate, de la un anumit punct putând fi folosite drept contraceptive subtile. Este nepotrivită punerea în discuŃie a renunŃării la utilizarea analogilor hormonali, dar prescrierea acestora trebuie făcută cu moderaŃie şi discernământ: buna cunoaştere a limitelor de utilizare şi respectarea acestora; prevenirea proprietarilor asupra eventualelor efecte iatrogene; exercitarea unei supravegheri pe termen scurt şi mediu; a nu se administra mai mulŃi analogi hormonali simultan. Efecte secundare generate de administrarea contraceptivelor • producŃia anormală a GnRH • inhibarea axului Hipotalamo-Hipofizo-Adrenal • tulburarea metabolismului glucozei • generarea neoplaziilor mamare • favorizarea producerii piometrului Controlul funcŃiei de reproducere la mascul • Chirurgical (orhiectomia, vazectomia) • Hormonal (androgeni, progestageni, androgeni + progestageni, steroizi anabolizanŃi, anti-androgeni) • Imunologic (generarea anticorpilor anti-gonadotropine, anti-GnRH, antispermatici) Administrarea steroizilor în scop contraceptive • testosteron, enantat de testosteron • androgeni administraŃi oral • progestageni (ciproteron acetat) • MAP + testosteron ContracepŃia la câine • androgeni • MAP (medroxi-acetat de progesteron) • propionat de testosteron (rezultate proprii) • injectarea intratesticulară a glicerolului, a argininei zincate • imunizarea antispermatică (rezultate proprii) La bărbat, contracepŃia vizează: • inhibarea producerii SPE în testicule • interferarea funcŃionalităŃii spermatozoizilor în epididim

• întreruperea transportului spermei prin canalul deferent • prevenirea depunerii spermei după ejaculare • prevenirea interacŃiunii SPE-ovocit în tractul genital femel OMS (date din 2001) • recunoaşte două contraceptive pentru bărbat • un tratament de 3 luni, vizând administrarea lunară a butanoatului de levonorgestrel + buciclat de testosteron sau doar a buciclatului de testosteron • ocluzionarea canalului deferent prin metode nechirurgicale Utilizarea canalului deferent în contracepŃie la bărbat A. Vazectomia • în ultimii 30 de ani, 40 de milioane de bărbaŃi (India) • nu afectează libidoul, sistemul cardio-vascular şi nu generează cancer de prostată sau testicular • vazectomie fără bisturiu (pensă hemostatică specială) • vazectomia nu este întotdeauna reversibilă (vazo-stomia) B. Dispozitive intra-vazale Firul intravazal ( nylon sau mătase chirurgicală) • Succes temporar, complet reversibilă • NU conferpă sterilitate totală Firele de Cupru • În metodele ocluzive, SPE se acumulează în epididim şi declanşează unele reacŃii imunologice, determinând creşterea titrului Ac anti SPE. Titrul crescut al Ac poate fi cauza ratei scăzute a G consecutiv procedurilor de restaurare a canalului deferent • Firul de Cu induce modificări de natură toxică în enzimele acrozomiale • Cu înlocuieşte zincul din acrozom • La animale, firele de Cu determină decapitarea SPE generând infertilitate • În timp, scade eficacitatea procedurii, datorită eroziunii firelor de Cu Dispozitiv electric intravazal • crt. el. modifică membrana acrozomială a SPE, sau crt. el. omoară SPE • Grafit-aluminiu înglobat în teflon, inclus în canalul deferent • Infertilitate la şobolan, reversibilă după deconectarea firului Valva de control BIONYX • Dispozitiv în formă de T, din aur, care se montează în lumenul canalului deferent şi are un canal central care poate fi deschis/închis, pentru a permite/împiedica trecerea SPE • Agrafe de tantaliu, plasate pe scrot, care să comprime canalul deferent (câine – nu este complet eficientă; iepure) – scoaterea lor este dificilă şi nu se restabileşte fertilitatea integral InjecŃii transcutanate Chimiosterilizarea • CombinaŃie de cianoacrilaŃi, la 600.000 de bărbaŃi; agent sclerozant, se solidifică în 20 de secunde • 96% azoospermie şi 99% prevenire sarcinii

• Sterilizare reversibilă; are aprobarea OMS • AlŃi agenŃi sclerozanŃi Dopuri injectabile • Elastomeri poliuretanici – 98% prevenirea sarcinii timp de 5 ani după injectare • Dopul poate determina ruperea canalului deferent • Gumă siliconică formată in situ – nu interferează semnificativ fiziologia canalului deferent şi după scoaterea dopului, mucoasa se regenerează şi permite trecerea SPE

MALE CONTRACEPTION INFORMATION PROJECT 2006 ww.NewMaleContraception.com SUA – 2% dintre femei fac un avort anual Europa de vest – 1% dintre femei fac anual un avort SUA - 20% dintre femei au primul copil înainte de a împlini 20 de ani disponibile: plasturele contraceptiv, inelul contraceptiv, dispozitivele intrauterine multe femei nu suportă efectele secundare prezervativul – eficienŃă de 985 (totuşi, generează 15% sarcini nedorite) bărbaŃii le resping deoarece reduc senzaŃiile MOR la naştere UNA din ŞASE femei (în Afganistan, Angola, Malawi, Nigeria, Sierra Leone), faŃă de UNA la 29.800 (SUEDIA) VAZECTOMIA – unul din şase americani în vârstă de peste 35 ani 500.000 de americani fac vazectomie în fiecare an teoretic este reversibilă – 30% din cazuri se soldează cu sterilitate permanentă schimbarea opticii şi a tradiŃiilor culturale – bărbaŃii devin dornici să îşi CONTROLEZE fertilitatea Olanda, Noua Zeelandă – 50% dintre familiile de peste 35 de ani – vazectomia E2 din pilule determină creşterea concentraŃiei SHBG (sex hormone binding globulin), care nu cuplează doar estrogenii ci şi hormonii tirodieni Efectul înrăutăŃeşte situaŃia celor 5 – 15% femei care suferă de tulburări ale tiroidei, sau a căror tiroidă funcŃionează la limită Aceste modificări subtile ale stării generale şi metabolismului energetic trec neobservate, îndeosebi datorită faptului că SHBG nu se analizează în cadrul testelor pentru tiroidă SHBG cuplează şi testosteronul – femeile îşi pierd libidoul PILULA CONTRACEPTIVĂ a deceniului şase conŃinea de ŞAPTE ori mai mult ESTROGEN şi de ZECE ori mai mult PROGESTAGEN decât în formulele actuale ContracepŃia la femei Plasturele – E2 şi P4 (se schimbă săptămânal – 3 săptămâni, una pauză) Diafragma – se inseră pe cervix – se adaugă spermicid (eficient 2 ore)

Lunelle – injecŃie lunară (E2 + P4) – eficienŃă de 99% ContracepŃia de urgenŃă (120 ore post coital) – scurtcircuitează reglarea hormonală Spermicide – geluri, spume, supozitoare Ligaturarea oviductelor NICIUNA dintre metode nu previne STD (bolile cu transmitere sexuală)

Disciplina de reproducţie obstetrică şi ginecologie Anul VI medicină veterinară CURSUL nr. 1 LACTAłIA Dezvoltarea glandei mamare Instalarea pubertăŃii – consecutiv fiecărui estru – creştere şi proliferare a canalelor galactofore – stimularea exercitată de ESTROGENI. GestaŃie – primele 4 luni – E2 în cantităŃi crescute – sistemul galactofor se dezvoltă. GestaŃie – a doua jumătate – predomină P4 – stimulează formarea lobulilor Ńesutului alveolar (acinii), loc al secreŃiei lactate. Acest proces se intensifică până la momentul parturiŃiei. Dezvoltarea mamelei – LTH, STH, ACTH, hormoni tiroidieni. Ugerul vacii capabil să producă lapte cam de pe la ½ a G; avort L VII – există suficient Ńesut alveolar ca să rezulte cantităŃi scăzute de lapte. Lactogeneza Modificările statusului hormonal peripartal: • E2 cresc la sfârşitul G; • P4 scade treptat şi se “prăbuşeşte” cu 24-48 de ore antepartum; • Corticoizii cresc foarte mult în preajma parturiŃiei; • LTH creşte cu 4-6 zile înaintea parturiŃiei. Progesteronul : • a stimulat dezvoltarea alveolară în G avansată; • prin scăderea sa bruscă, a permis creşterea LTH; • blochează receptorii mamari pentru cortizol; prin scăderea P4, cortizolul poate acŃiona asupra glandei mamare. EjecŃia laptelui • Laptele secretat în Ńesutul alveolar se acumulează în canalele şi sinusurile galactofore precum şi în cisterna galactoforă (80%). • EjecŃia – OCITOCINA. Ocitocina (OT) • Eliberarea OT – stimuli de la receptorii senzoriali din uger, mameloane şi organele genitale, fiind şi rezultatul sunetelor şi reflexelor asociate cu suptul sau mulsul. • OT – viaŃă biologică scurtă, sub 2 minute – NECESARĂ RESTIMULAREA. • OT – eliberată sub formă pulsatilă.

INDUCEREA ARTIFICIALĂ A LACTAłIEI Posibilă în cazul mimării statusului hormonal peripartal şi a modificărilor glandei mamare METODA A • InjecŃie combinată (10 mg benzoat de estradiol şi 100 mg P4) în zilele 0, 3, 6, 9, 12, 15, 18, 21, 24, 27 şi 30. • În zilele 31 şi 32, 20 mg dexametazon i.m. • Din ziua 10, femelele trebuie duse la standul de muls, ugerul trebuie masat şi aparatul de muls aplicat scurt timp. • Producerea laptelui poate începe înaintea sfârşitului tratamentului sau până la o săptămână după terminarea sa. • • •

METODA B InjecŃie combinată, repetată la 12 ore (benzoat de estradiol 0,05 mg/kg şi P4 0,125 mg/kg), 7 zile consecutiv ( 14 injecŃii în total). 20 mg beta sau dexametazon în zilele 18, 19 şi 20. Masajul ugerului şi muls, precum la metoda “A”.

REZULTATE : • Aproximativ 20% din tratamente nu reuşesc. • ProducŃia de lapte este aprox. 70% din cea aşteptată. • Fertlitatea ulterioară este normală. • Unele vaci- simptome de nimfomanie, pe parcursul tratamentului cu E2. INDICAłII : Vaci cu producŃie bună, dar care nu au devenit G, să rămână în efectiv, ca să poată fi folosite în continuare la reproducŃie, în anul următor (dacă fătările sunt grupate pe sezoane). Pentru a menŃine în efectiv vacile bune producătoare care sunt infertile sau posibil sterile, mai degrabă decât a recurge la înlocuiri costisitoare. Venkatramaiah şi col., 1993 – Vet.Bulletin vol.63, nr.5, p 511, rezumat 3378 – Lactation induction by hormonal treatment in infertile bovines. 8 vaci infertile – tratate fie cu PRID, fie cu norgestomet implant, timp de 7 zile şi 0,1 mg estradiol benzoat/kg în 2 doze separate, 7 zile consecutiv. Au fost de asemenea injectate cu 6 µg reserpină/ kg sau 100 mg largactil/kg în zilele 14 şi 16 consecutiv tratamentului iniŃial, şi 8 mg dexametazon/ kg în zilele 18 şi 20. Consecutiv suprimării P4, s-a masat ugerul de 2 ori/zi. Mulsul manual a fost iniŃiat în ziua 21. LactaŃia a fost indusă la toate animalele (1 a murit). Estrul a fost indus la 6 din cele 8 femele, iar 3 dintre ele au rămas gestante.

INDUCEREA LACTAłIEI Croker B.A. et al – 2003 – Induced Lactation – If Approved, Would it be Economical ? Inducerea lactaŃiei: 7 zile consecutiv, prin 2 administrări zilnice a câte 0,05 mg/kg corp E2 şi 0,125 mg/kg corp P4 DEXametazon 0,05 mg/kg în ziua a 14-a MULSUL se începe în ziua a 15-a Studiu realizat pe vaci reformă, sub supravegherea FDA, cu 17 zile de aşteptare pentru lapte şi 53 de zile pentru carne, după ultima administrare de progesteron în studiu au fost incluse vaci care au avut cel puŃin 250 de zile de lactaŃie, un nivel de minim 8400 litri lapte pe 305 zile de lactaŃie vacile au fost înŃărcate timp de 60 de zile, apoi indusă lactaŃia inducerea a fost considerată reuşită dacă producŃia de lapte a depăşit 15 litri de lapte/zi în săptămâna a 7-a de lactaŃie lactaŃia a fost indusă la 87% din vacile tratate (28 din 32) vacile au produs în medie 25 de litri de lapte pe zi

Magliaro A.L. et al – Induced Lactation in Nonpregnant cows: Profitability and response to Bovine Somatotropin – 2004, J Dairy Sci 87:3290-3297 Includerea BST în protocoalele de inducere a lactaŃiei ar putea avea următoarele efecte: 1. creşterea procentului de vaci care produc lapte din totalul vacilor tratate 2. creşterea cantităŃii de lapte produse pe parcursul lactaŃiei 3. reducerea efectelor negative ale anotimpului (scurtarea zilei lumină) asupra proporŃiei vacilor la care se induce lactaŃia din totalul celor tratate, precum şi asupra producŃiei de lapte Studiul a arătat că administrarea BST după protocolul de inducere sporeşte nivelul producŃiei de lapte cu 17,8% (28,4 litri / zi, faŃă de martor – 24,1 litri /zi) protocolul de inducere s-a bazat pe 7 zile de E2 +P4 şi muls începând din ziua a 18-a dpdv economic, vacile cu lactaŃie indusă (vaci negestante) au fost comparate cu primiparele (la producŃia de lapte), rezultând la vacile induse (şi tratate cu BST) un profit de 1966 USD per lactaŃie, comparativ cu primiparele (1446 USD) utilizarea BST este profitabilă

Utilizarea hormonului de creştere (GH, somatotrop, bST) pentru sporirea producŃiei de lapte • GH este hormonul galactopoietic principal la vacă, fiind în mod curent utilizat pentru creşterea producŃiei de lapte • tratarea vacilor cu bST creşte nivelul producŃiei de lapte cu 10 – 40%, prin afectarea mamogenezei şi lactogenezei GH acŃionează prin: • intermediul IGF 1 (“axul GH – IGF 1)

• • • •

stimulează sinteza hepatică de IGF1 (creşte nivelul circulant) precum şi sinteza mamară a IGF1 modificări metabolice (modificarea repartiŃiei nutrienŃilor disponibili) GH favorizează ANABOLISMUL glandei mamare şi CATABOLISMUL extra-mamar scăderea nivelului de asimilare a glucozei şi intensificarea producerii lactatului în muşchi favorizează creşterea producŃiei de lapte şi a conŃinutului acestuia în grăsime, proteină şi lactoză la vacile tratate cu bST.

InfluenŃa nivelului producŃiei de lapte asupra metabolismului şi funcŃiei de reproducere în perioada puerperală • ProducŃii mari de lapte (peste 6500 l/lactaŃie) = necesar ridicat de energie • INEVITABIL (ingesta/producŃia de lapte) apare NEB (bilanŃ energetic negativ) •

Amplitudinea NEB : producŃia de lapte şi apetitul peripartal

NEB reduce pulsatilitatea LH în perioada postpartală, amânând prin aceasta reluarea activităŃii ovariene (Lucy -2001) NEB generează şi un bilanŃ proteic negativ: • Ficatul – neoglucogeneză; nivel scăzut al glucozei = AC.PROPIONIC puŃin disponibil • Ficatul utilizează CARBOHIDRAłI din aminoacizi glucogeni, asiguraŃi prin PROTEOLIZĂ • Scade disponibilitatea AA necesari sintezei hepatice a apoproteinelor (transportorii TAG spre glanda mamară, pentru lapte) ConsecinŃe: • Starea ficatului – modificarea sintezei hepatice a IGF • IGF – rol important în creşterea şi dezvoltarea foliculară • Tulburări ale creşterii şi dezvoltării foliculare, implicit ale ovulaŃiei şi ciclicităŃii sexuale FRECVENłA MAMITELOR ŞI PIERDERILE DATORATE MAMITELOR • 14% cazuri irecuperabile (incurabile) • 8% lapte necorespunzător (mamitic sau cu reziduuri de antibiotice) • 8% cheltuieli medicaŃie, asistenŃă veterinară, examene de laborator • 70% pierderi în producŃie (lapte, parametri reproductivi) FIECARE compartiment afectat, suferă următoarele pierderi (scade producŃia de lapte): • 9% , dacă există 500.000 - 1.000.000 celule / ml lapte (mamită subclinică) • 18% , dacă există peste 1.000.000 celule / ml lapte (mamită clinică) • 37% , atunci când sunt peste 5.000.000 celule / ml lapte • pierderile unuia dintre compartimente nu sunt compensate de celelalte compartimente !!! Laptele mamitic are un conŃinut redus de grăsimi, cazeină şi lactoză

Reziduurile de antibiotice, pericol pentru persoanele alergice Etiopatogenia mamitelor : PredispozanŃi : • producŃiile mari de lapte • mulsul incomplet • retenŃia laptelui • edemul mamar FavorizanŃi: • excesul proteic • subalimentaŃia şi dezechilibrele nutriŃionale • subinvoluŃia şi infecŃiile uterine Glanda mamară se apără prin : • mecanismul umoral (imunitatea moştenită) • imunitatea dobândită apărarea celulară cuprinde: macrofage, limfocite şi neutrofile aspecte genetice : • selecŃia pe baza SCC scăzut • SCC scăzut - creşte riscul mamitelor • corelaŃie pozitivă între nivelul crescut al producŃiei de lapte şi frecvenŃa mamitelor • selecŃia pe baza aspectelor clinice (mamite) inclusă în programul de selecŃie în Ńările scandinave (evidenŃă naŃională) vacile în purperium sunt imunocompromise : • stresul indus în mod fiziologic de lactogeneză • numărul scăzut al neutrofilelor capabile de fagocitoză • răspunsul inflamator întârziat • capacitatea redusă a neutrofilelor de a anihila bacteriile InfecŃia mamară se produce: • ascendentă (galactoforă) - flora microbiană pătrunde prin canalul papilar în sinusul galactofor • descendentă (hematogenă) - endometrite sau TBC • limfatică - leziuni cutanate factori antibacterieni din lapte: SPECIFICI • imunoglobulinele – ag. opsonizanŃi – previn colonizarea cu bacterii – neutralizează toxinele – pătrund în uger pe parcursul procesului inflamator NESPECIFICI • complementul • lizozimul • sistemul lactoperoxidază - tiocianat

•

lactoferina

Cauzele insucceselor tratamentelor în mamite : 1. Diagnosticul tardiv, determinat de : (a) supravegherea insuficientă a efectivelor şi competenŃa redusă a îngrijitorilor şi (b) debutul insidios, adesea inaparent. ConsecinŃa - instituirea tratamentului după relativ mult timp de la debutul bolii. 2. Folosirea unor medicamente inactive sau în doze insuficiente, precum şi rezistenŃa germenilor faŃă de substanŃele folosite (utilizarea insuficientă a antibiogramei şi a diagnosticului bacteriologic). 3. ExistenŃa unor focare infecŃioase profunde, neafectate de medicaŃia utilizată. 4. Suspendarea timpurie a tratamentului după dispariŃia semnelor clinice (inflamaŃia locală şi normalizarea secreŃiei), înainte de a se fi produs “sterilizarea” mamelei (recidive). 5. Nerespectarea tehnicilor de terapie (este cauza cea mai frecventă de apariŃie a mamitelor micotice). 6. MenŃinerea în efectiv a vacilor purtătoare de germeni (mai multe mamite în aceeaşi lactaŃie sau mamite cronice purulente) şi mulgerea lor împreună cu femelele sănătoase. Tratamentul mamitelor cronice : • parenchimul mamar grav lezat şi înlocuit cu Ńesut conjunctiv (fibroză şi scleroză mamară). • OBIECTIV: distrugerea florei bacteriene, pentru a nu mai disemina infecŃia • pierderi prin agalaxia compartimentului afectat şi hipogalaxia celor sănătoase • afectată producŃia vacilor după a 3-a lactaŃie (când scade posibilitatea înlocuirii Ńesutului glandular secretor). Tratamentul mamitelor subclinice : • acoperit (toate sferturile mamare, la toate vacile) • selectiv al vacilor (toate compartimentele la vacile care au unul sau mai multe sferturi afectate) • selectiv al compartimentelor infectate (doar sferturile pozitive la testele paraclinice) Profilaxia mamitelor la vacă • controlul periodic al vacilor, în special după fătare, de 2 ori în primele 30 de zile p.p. • examenul laptelui prin teste rapide (CMT) • numărarea celulelor somatice din lapte • cunoaşterea momentului apariŃiei mamitei (repaus mamar sau lactaŃie) şi tratamentele precedente • echipamentul de muls şi funcŃionarea sa • igiena mulsului (curăŃirea instalaŃiei de muls şi a mamelei, toaleta şi asepsia mamelei înainte şi după muls, corectitudinea cu care se face mulsul).

•

pentru fiecare efectiv, plan coerent, a cărui îndeplinire se verifică periodic

tratarea corectă a mamitelor clinice şi a celor subclinice (în cazul creşterii frecvenŃei lor, se impune tratarea întregului efectiv în repaus mamar) determină scăderea semnificativă a frecvenŃei mamitelor în efectiv • tratarea corespunzătoare a afecŃiunilor genitale şi a celor podale Vaccinarea: • nr. mare al agenŃilor patogeni precum şi heterogenitatea lor • specificitatea: corespunzător împotriva UNUI ag. patogen, nu şi a altuia • Ig pătrund în uger DOAR după declanşarea mamitei • vaccin care stimulează diapedeza polimorfonuclearelor în infecŃiile intramamare Imunomodulatorii: • levamisolul • Propionibacterium acnes • complexele cazeinei • citokine inductoare ale secreŃiei de interferon alte soluŃii : • stimularea rezistenŃei prin determinarea gl. mamare să producă proteine protectoare străine sau peptide antibacteriene (prin transgeneză) • Finlanda - vaci puse să producă LF umană în lapte, au avut un SCC foarte scăzut în laptele lor şi au făcut foarte rar mamite Programe de combatere a mamitelor • se includ toate măsurile enunŃate la profilaxie • se pune accent pe prevenirea apariŃiei noilor infecŃii pe parcursul lactaŃiei precum şi pe eliminarea în perioada de repaus mamar a celor subclinice Congresul de Buiatrie (1996) - “Programul în cinci puncte” • imersia mameloanelor • tratamentul total în perioada înŃărcării • curăŃenia şi acŃiunea corectă a maşinii de muls • reformarea vacilor • tratarea cazurilor clinice În adăpost, trebuie avut în vedere că: • paiele se asociază cu un număr crescut al streptococilor • rumeguşul sau surcelele favorizează mamitele acute cu germeni coliformi • o pantă a pardoselii de 2-3% reduce acumularea urinei şi a apei • ventilaŃia corespunzătoare asigură menŃinerea uscată a adăpostului şi a aşternutului • se recomandă evitarea aglomeraŃiei şi a efectivelor mult prea mari Referitor la creşterea rezistenŃei organismului femelei • se va investiga ce anume favorizează pătrunderea germenilor pe canalul papilar • alimentaŃia favorizează rezistenŃa (vitamina E şi Seleniul stimulează activitatea macrofagelor) • imunizarea împotriva Streptococcus uberis (Anglia) şi Staphilococcus aureus (SUA) generează un succes limitat •

Scăderea numărului de celule somatice duce la scăderea incidenŃei mamitelor şi pe scăderea numărului de celule se bazează întregul complex de măsuri profilactico - curative Mamitele la alte specii : • cabaline (durata lactaŃiei) • ovine - caprine (infecŃioase) • suine (sindromul MMA) • canide (lactaŃia nervoasă şi mamitele induse de “înŃărcarea intempestivă”)