IFC (Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research).

Volume 4, Issue 2 (Mar-Apr), 2016 ISSN 0719-4250

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IFC (Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research).

i

Original article | Artículo original Jhoany Acosta, Iliana Sevilla, Suslebys Salomón, Lauro Nuevas, Aylema Romero, Daniel Amaro (2016) Determination of mangiferin solubility in solvents used in the biopharmaceutical industry. [Determinación de la solubilidad de la magiferina en diferentes disolventes usados en la industria biofarmacéutica].

49-53

Original article │ Artículo original Rajamanickam Manivannan (2016) Isolation of apigenin-7-O-(6’’-O-E-caffeoyl)-β-Dglucopyranoside from Leucas aspera L. with anti-inflammatory and wound healing activities. [Aislamiento de apigenina-7-O-(6’’-O-E-cafeoil)-β-D-glucopiranósido deLeucas aspera L. con actividad anti-inflamatoria y cicatrizante].

54-61

Review │ Revisión Wilfredo Mañon Rossi, Gabino Garrido, Alberto J. Núñez Sellés (2016) Biomarcadores del estrés oxidativo en la terapia antioxidante. [Biomarkers of oxidative stress in antioxidant therapy].

62-83

Original article │ Artículo original Marian Hernández-Colina, Alberto Martín Cermeño, Alexis Díaz García (2016) Selective cytotoxic effect of 1-O-undecylglycerol in human melanoma cells. [Efecto citotóxico selectivo del 1-Oundecilglicerol en células de melanoma humano].

J Pharm Pharmacogn Res JPPRes

84-94

© 2016 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research ISSN 0719-4250 http://jppres.com/jppres

JOURNAL OF PHARMACY & PHARMACOGNOSY RESEARCH For specialists working in the pharmaceutical and herbal fields The Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research (JPPRes) is an international, specialized and peer-reviewed open access journal, which publishes studies in the pharmaceutical and herbal fields concerned with the physical, botanical, chemical, biological, toxicological properties and clinical applications of molecular entities, active pharmaceutical ingredients, devices and delivery systems for drugs, vaccines and biologicals, including their design, manufacture, evaluation and marketing. This journal publishes research papers, reviews, commentaries and letters to the editor as well as special issues and review of pre-and post-graduate thesis from pharmacists or professionals involved in Pharmaceutical Sciences or Pharmacognosy. JPPRes has an acceptance rate of 50%. The average time between submission and final decision is 45 days and the average time between acceptance and final publication is 15 days. Manuscripts submitted to JPPRes are only accepted on the understanding that they are subject to editorial review and that they have not been, and will not be, published in whole or in part in any other journal.

Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research (JPPRes) es una revista internacional, especializada y con revisión por pares, la cual publica estudios científicos en los campos farmacéuticos y farmacognósticos, relacionados con la física, botánica, química, propiedades biológicas, toxicológicas y aplicaciones clínicas de entidades moleculares, ingredientes farmacéuticos activos, dispositivos y sistemas de administración de medicamentos, vacunas y productos biológicos, incluyendo su diseño, fabricación, evaluación y comercialización. Esta revista publica artículos de investigación, revisiones, comentarios y cartas al editor, así como ediciones especiales y las reseñas de libros y tesis de pre y postgrado de los farmacéuticos o los profesionales que intervienen en Ciencias Farmacéuticas y Farmacognosia. JPPRes tiene una tasa de aceptación de 50%. El tiempo promedio entre la presentación del manuscrito y la decisión final es de 45 días y el tiempo medio entre la aceptación final y la publicación es de 15 días. Los manuscritos presentados a JPPRes se aceptan solamente en el entendimiento de que son objeto de revisión editorial y que no han sido, ni serán, publicados en su totalidad o en parte en cualquier otra revista.

Editorial Office (for submission queries and papers under review, according with the JPPRes Instructions): [email protected] Executive Editor (for accepted and published papers only): [email protected]

EDITOR-IN-CHIEF Gabino Garrido, Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile. E-mail: [email protected]

EXECUTIVE EDITOR Marisela Valdés González, Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Universidad Católica del Norte, Antofagasta, Chile. E-mail: [email protected]

EDITORIAL AND DESIGN MANAGER Xavier Garrido Valdés. Universidad Santo Tomás, Antofagasta, Chile.

EDITORIAL BOARD MEMBERS Carla Delporte (Santiago, Chile) Damaris Silveira (Brasília, Brazil) Douglas S. de A. Chaves (Rodovia, Brazil) Edgar Pastene (Concepción, Chile) Etile Spegazzini (Buenos Aires, Argentina) Farid Chemat (Avignon, France) Fidel O. Castro (Chillán, Chile) Guilherme N. L. do Nascimento (Tocantins, Brazil) Jacqueline Sepúlveda (Concepción, Chile) Jelena Nadinic (Buenos Aires, Argentina)

José H. Isaza-Martínez (Cali, Colombia) Juan C. Sepúlveda-Arias (Pereira, Colombia) Madan M. Gupta (Trinidad & Tobago, West Indies) Mahomoodally M. Fawzi (Réduit, Mauritius) María Inés Isla (Tucumán, Argentina) Marisol Fernández Alfonso (Madrid, España) Mayank Gangwar (Varanasi, India) Silvia Debenedetti (Buenos Aires, Argentina) Vikash Kumar Ruhil (Haryana, India) Yasser Shahzad (Huddersfield, United Kingdom)

REVIEWERS The reviewers will be recruited among researchers and clinicians with high international reputation in Pharmacy and Pharmacognosy and supported by members of the editorial board. Abstracted/indexed in: Web of Science™ Core Collection Emerging Sources Citation Index (ESCI), LATINDEX, Directory of Open Access Journal, REDIB, Google Scholar, PERIODICA, BIBLAT, HINARI, Chemical Abstract, SHERPA/RoMEO.

© 2016 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, 4 (2), 49-53 ISSN 0719-4250 http://jppres.com/jppres Original Article | Artículo Original

Determination of mangiferin solubility in solvents used in the biopharmaceutical industry [Determinación de la solubilidad de la magiferina en diferentes disolventes usados en la industria biofarmacéutica] Jhoany Acosta1, Iliana Sevilla1*, Suslebys Salomón2, Lauro Nuevas3, Aylema Romero2, Daniel Amaro4 1Centro

de Ingeniería de Procesos (CIPRO). Facultad de Ingeniería Química. Instituto Superior Politécnico José A. Echeverría. Calle 114 No. 11901 e/ 119 y 127. Marianao. La Habana. Cuba. 2 Centro de Investigación y Desarrollo de Medicamentos (CIDEM), 26 y 51, Plaza, La Habana, Cuba. 3Centro Nacional de Genética Médica. Ave, 31 y 146, Playa, La Habana, Cuba. 4Centro de Imunologia Molecular (CIM). Calle 17 y 216. Playa, La Habana, Cuba. *E-mail: [email protected]

Abstract

Resumen

Context: Pharmacological properties and studies of methods of extraction of mangiferin have been reported, but there are not studies related to the solubility of mangiferin in the solvents used in the pharmaceutical industry.

Contexto: Los métodos de extracción de la mangiferina y sus propiedades farmacológicas han sido ampliamente estudiados, pero no aparece reportado ningún estudio de solubilidad de la mangiferina en los solventes usados comúnmente en la industria farmacéutica.

Aims: Study the solubility of mangiferin in different solvents used in the pharmaceutical industry.

Objetivos: Determinar la solubilidad de la mangiferina en diferentes solventes empleados en la industria farmacéutica.

Methods: The mangiferin used had a purity of 97.3% determined by HighPerformance Liquid Chromatographic (HPLC), and solubility measurements were made in ethanol, methanol, water, acetone, diethyl ether, and hexane at 5, 15, 30, 40, 50 and 600C of temperature. The mangiferin concentrations were determined by ultraviolet spectrometry at 254 nm. The experimental solubility data were correlated with the Van´t Hoff equation and the dissolution heat determined.

Métodos: Se empleó una mangiferina con un 97,3% de pureza determinada por Cromatografía Líquida de Alta Resolución (CLAR). Los disolventes utilizados fueron agua, etanol, metanol, éter etílico, acetona y n-hexano y las mediciones se realizaron a las temperaturas de 5, 15, 30, 40, 50 y 60°C. Las concentraciones de mangiferina en cada solvente fueron determinadas mediante espectroscopía UV-Vis a 254 nm. Los datos de solubilidad fueron correlacionados mediante la ecuación de Van´t Hoff para determinar los calores de disolución.

Results: The solubility of mangiferin in pure solvents decreases with increasing of temperature and in the following order: ethanol>methanol>water>diethyl ether>acetone>n hexane. Conclusions: This results indicated that mangiferin is slightly soluble in ethanol, sparingly soluble in methanol and water and practically insoluble in diethyl ether, acetone, and n-hexane. Keywords: Mangiferin; solubility; Van’t Hoff equation.

Resultados: La solubilidad de la mangiferina en los solventes puros disminuye con el aumento de la temperatura en el orden: etanol>metanol>agua>éter etílico>acetona>n hexano. Conclusiones: La mangiferina fue moderadamente soluble en etanol, ligeramente soluble en metanol y agua y prácticamente insoluble en éter etílico, acetona y n-hexano. Palabras Clave: Ecuación de Van’t Hoff; mangiferina; solubilidad.

ARTICLE INFO Received | Recibido: November 16, 2015. Received in revised form | Recibido en forma corregida: January 27, 2016. Accepted | Aceptado: February 1, 2016. Available Online | Publicado en Línea: February 5, 2016. Declaration of interests | Declaración de Intereses: The authors declare no conflict of interest. Funding | Financiación: This work was support by a project PR-0136, CIDEM-CUJAE (Cuba). Academic Editor | Editor Académico: Gabino Garrido.

_____________________________________

Acosta et al.

Mangiferin solubility studies

INTRODUCTION Mangiferin (Fig. 1), is a xanthone widely distributed in higher plants such as Mangifera indica L. (Núñez et al., 2002) and Anemarrhena asphodeloides Bung (Chul et al., 2006), showing antidiabetic (Muruganandan et al., 2005), antitumor (Sarkar et al., 2004), antiviral (Zhu et al., 1993), antioxidant (Dar et al., 2005), immunomodulatory (Guha et al., 1996; Leiro et al., 2004a;b), and anti-inflammatory (Garrido et al., 2004; Prabhu et al., 2006) activities. CH2OH

O

H H OH OH H

OH

O

H

OH

H OH

OH

O

HO

Figure 1. Molecular structure of mangiferin.

A variety of pure solvents has usually been employed in a reaction and separation process during manufacturing of pharmaceuticals. Therefore, solubility data of bioactive compounds have a broad application and great importance in the pharmaceutical industry. It is very well known that the solubility behavior of drugs in solvent mixtures is very significant because solvents blends are frequently used in purification methods, pre-formulation studies, among other applications (Yalkowsky, 1999). For these reasons it is important to determine systematically the solubility of drugs to obtain complete information about physicochemical data for pharmaceutical systems. Otherwise, tempera-

ture-solubility dependence allows perform the respective thermodynamic analysis, which, on the other hand, also allows inside the molecular mechanisms involved in the solution processes. The Dictionary of Natural Products and the Chemical Booklist show that the mangiferin is practically insoluble in diethyl ether, n-hexane, and water (DPN, 2005; CBL, 2014). However, according to a bibliographical search, there are no quantitative values of mangiferin in these solvents. A review of the literature indicates that studies on mangiferin have been focused on preparations or clinical treatments and patent of manufacture while little work has been carried out about the solubility of mangiferin. In the present work, we have measured the solubility of mangiferin in water and five organic compounds commonly used in the pharmaceutical industry in the range of 5 to 60°C of temperature. MATERIAL AND METHODS Materials Ethanol, methanol, diethyl ether, acetone, hexane were supplied as a chromatographic grade by Merck with purities exceeding 99.5% and they were used without previous purification. However, purities of the solvents were checked by gas chromatography. Deionized water was supplied from our laboratory. Experimental data of density and refractive index of solvents are given in Table 1 (Riddick, 1986).

Table 1. Comparison of densities (ρ) and refractive indexes (ηD) of pure components with literature data at 30°C and atmospheric pressure. Solvents

 (g cm−3)

nD

Boiling point

Literature*

Experimental

Literature*

Experimental

(0C)

Methanol

1.3288

1.3300

0.7914

0.7953

64.6

Ethanol

1.3611

1.3614

0.7893

0.7902

78.5

Diethyl ether

1.3530

1.3532

0.7135

0.7125

34.5

Acetone

1.3588

1.3589

0.7899

0.7910

56.05

Hexane

1.3751

1.3751

0.6548

0.6551

69

Water

1.33250

1.3325

0.9970

0.9970

100

*Source: Durst and Gokel, 1985. http://jppres.com/jppres

J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 50

Acosta et al.


in. Each experiment was conducted in triplicate. Concentrations were determined by measuring absorbance after appropriate dilution and interpolation from previously constructed UV spectrophotometric calibration curve.

Mangiferin (MGD13020) was purchased by CIDEM, and the purity was verified by HPLC (Shimadzu, Japan) to take account the method development in the literature (Salomón et al., 2014). The determined purity was 97.3 mass percent.

Statistical analysis Apparatus and procedure

Data were analyzed using the statistical program STATGRAPHICS PLUS Version 5.1 1994 – 2001. Intra- and inter-groups statistically significant differences were tested using one-way analysis of variance (ANOVA). The results are presented as mean ± standard deviation (SD). P-value < 0.05 was considered statistically significant.

Solubility measurements were made at 5, 15, 30, 40, 50 and 60°C of temperature. Mangiferin decomposes at temperatures higher than 273°C. The mangiferin concentrations were determined by ultraviolet (254 nm) spectrometry with a UV spectrometer (Shimadzu, UV mini 1240, Japan). A mechanically stirred jacketed glass vessel (200 mL), equipped with a thermometer a reflux condenser with a CaCl2 tramp, and closed by a glass plug was used by the solubility studies. The temperature of the vessel was controlled by circulating thermostated water in the jacket, and it was maintained constant. The temperature was measured with an accuracy of ± 0.1°C. The content of the vessels was stirred at 250 rpm. The mass of mangiferin (about 1 g) was chosen to be in excess of the highest estimated solubility in the chosen solvents (about 150 mL. At each temperature, samples of supernatant (1 mL) were withdrawn from the stirred vessel after a long time (about 8 hours). A portion of the solution (10 mL) was taken and centrifuged at 2200 rpm for 20 min. Samples were filtered through a 0.45 µm (Sartorius, Switzerland) membrane to exclude solid mangifer-

RESULTS Solubility studies In all solvents studied solubility increase with the increase of temperature. Highest values of solubility of mangiferin were obtained with ethanol and methanol, and the smallest values were obtained using n-hexane (Table 2). ANOVA test indicates that there is a significance difference between ethanol and methanol with water, ether, acetone and n-hexane for the temperatures of 5 and 150C. In the case of 30 and 450C, hexane, acetone and ether are significantly different from water, methanol and ethanol and for the temperature of 600C all the solvents studied are significantly different.

Table 2. Average values of mangiferin solubility in different solvents used in the pharmaceutical industry. Temperature (0C) Solvents

5

15

30

45

60

Solubility (g of mangiferin per 100 g of solvent) Ethanol

0.5230 ± 0.6776a

0.7122 ± 0.2461a

1.2516 ± 0.0469a

2.3493 ± 0.2092a

2.5189 ± 0.0286a

Methanol

0.4988 ± 0.0673a

0.7005 ± 0.0525a

0.8880 ± 0.1102b

1.1454 ± 0.0472b

1.1328 ± 0.0583b

Water

0.1611 ± 0.0206b

0.1808 ± 0.0113b

0.1958 ± 0.0373c

0.2487 ± 0.0190c

0.3931 ± 0.0165c

Diethyl ether

0.0022 ± 0.0004c

0.0032 ± 0.0002b

0.0043 ± 0.0003d

-

-

Acetone

0.0013 ± 0.0002c

0.0015 ± 9.36E-05b

0.0016 ± 0.0002d

0.0021 ± 0.0008d

-

n-Hexane

0.0003 ± 0.0002c

0.0012 ± 0.0006b

0.0015 ± 0.0005d

0.0017 ± 0.0005d

0.0038 ± 0.0006d

Data are presented as mean ± SD. Each group included five replicates. For each temperature same letters are no significant different according to an ANOVA test (p > 0.05) http://jppres.com/jppres


Acosta et al.


Solubility correlation The solubility of mangiferin in methanol, acetone, ethanol, diethyl ether, n-hexane and water was correlated according to the Van΄ t Hoff equation (1). (1) Where CS is the solubility of mangiferin, T is the temperature and α, β are the correlations coefficients. According to Van’t Hoff analysis, the standards heat of solution is obtained from the slope of ln Cs vs. 1/T plot according to equation (2). (2) Table 3 shows the values for the parameters α and β and the correlations coefficients. In all cases the standards heat of solution are positive, that means there is an endothermic process, having the major value absorbed with n-hexane and the small value with acetone. Table 3. Values for the Van’t Hoff parameters α and β and the correlation coefficients (r). Solvent

α

β

R

ΔH (kJ/mol)

Ethanol

9.695

-2873

0.968

23.87

Methanol

4.232

-1341

0.936

11.14

Water

3.066

-1381

0.879

11.48

Diethyl ether

1.920

-2225

0.974

18.49

Acetone

-3.126

-980

0.930

8.14

n-Hexane

4.956

-3515

0.837

29.21

DISCUSSION The solubility of mangiferin increased with an increased in the temperature in each solvent. This result is correct due to when the temperature increased to improve the process of dissolution of solute and the solubility increased.

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Polar molecule dissolves easily in a polar solvent, which is the so-called empirical rule that “like dissolves like”. During dissolution, the cohesive energy of the bonds holding solute together and the energy cost of disrupting the solvent-solvent bonds must be overcome by the cohesive energy released by the formation of the solute-solvent bonds. If these energies are approximately equal, which occurs when the solute and the solvent molecular are structurally similar, then the solute will dissolve in the solvent. The molecular structure of the title compound (see Fig. 1) shows that mangiferin is a molecule with intermediate polarity; hence, it can be dissolved in ethanol. However, a report explains that mangiferin obtained from Cyclopia subternata is more soluble in acetonitrile, methanol, and ethanol by this order (Maicu, 2008). Other authors comment that the presence of water facility the extraction of phenolic compounds due to the increased of solubility for the variety of polarity and the chemical nature of this metabolite (Bergeron et al., 2005). Furthermore, mangiferin is slightly soluble in ethanol, sparingly soluble in methanol and water and practically insoluble in diethyl ether, acetone, and n-hexane. Hence, diethyl ether, acetone, and n-hexane can be used as an antisolvent. In general, linear regression models with a high adjusted determination coefficient values (R2) were obtained (greater than 0.80). For this reason, it is considered that the Van’t Hoff equation is useful for estimating the enthalpies of the solution in all solvents. CONCLUSIONS The solubility of mangiferin was determined experimentally in ethanol, methanol, water, diethyl ether, acetone, and n-hexane at different temperatures. For all cases was observed that increased the solubility of mangiferin respect to increasing of temperature. Mangiferin was slightly soluble in ethanol, sparingly soluble in methanol and water and practically insoluble in diethyl ether, acetone, and n-hexane. The experimental solubility data were correlated with a Van΄t Hoff equation and the standards heat of solution for the different solvents was calculated J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 52

Acosta et al.

for the first time, obtaining a major heat absorbed with n-hexane. CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest.

ACKNOWLEDGEMENT This work was support by a project PR-0136, CIDEMCUJAE (Cuba).

REFERENCES Bergeron C, Gafner S, Clausen E, Carrier DJ (2005) Comparison of the chemical composition of extracts from Scutellaria lateriflorausing accelerated solvent extraction and supercritical fluid extraction versus standard hot water or 70% ethanol extraction. J Agric Food Chem 53: 3076-3080. CBL: Chemical Book List (2014). http://www.chemicalbook.com/ChemicalProductProperty _EN_CB8723435.htm [Consulted March 16, 2014]. Chul K, Mi-Jeong A, Jinwoong K (2006) Preparative isolation of mangiferin from Anemarrhena asphodeloides rhizomes by centrifugal partition chromatography. J Liq Chromatogr Relat Technol 29: 869–875. Dar A, Faizi S, Naqvi S, Roome T, Zikr-ur-Rehman S, Ali M, Firdous S, Moin ST (2005) Analgesic and antioxidant activity of mangiferin and its derivatives: the structure activity relationship. Biol Pharm Bull 28(4): 596-600. DPN: Dictionary of Natural Products on CD-ROM (2005) Chapman & Hall/CRC. Chemical Database ver. 13:2. London, UK. Durst HD, Gokel GW (1985) Química orgánica experimental. Ed. Reverte, pp. 122-126. Garrido G, Delgado R, Lemus Y, Rodriguez J, Garcia D, Nunez AJ (2004) Protection against septic shock and suppression of tumor necrosis factor alpha and nitric oxide production on macrophages and microglia by a standard aqueous extract of Mangifera indica L. (VIMANG). Role of mangiferin isolated from the extract. Pharmacol Res 50: 165-172. Guha S, Ghosal S, Chattopadhyay U (1996) Antitumor, immunomodulatory and anti-HIV effect of mangiferin, a


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Isolation of apigenin-7-O-(6’’-O-E-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside from Leucas aspera L. with anti-inflammatory and wound healing activities [Aislamiento de apigenina-7-O-(6’’-O-E-cafeoil)--D-glucopiranósido de Leucas aspera L. con actividad anti-inflamatoria y cicatrizante] Rajamanickam Manivannan* Department of Chemistry, Government Arts College (Autonomous), Kumbakonam, Tamilnadu-612001, India. *E-mail: [email protected] Abstract

Resumen

Context: Leucas aspera L. (Labiatae) is a common aromatic herb and grows generously in South India and in the broad area of South Asia. Traditionally, this species is taken orally for analgesic, anti-inflammatory, anti-bacterial and wound healing treatments.

Contexto: Leucas aspera L. (Labiatae) es una hierba aromática común y crece generosamente en el sur de la India y en la zona amplia del sur de Asia. Tradicionalmente, esta especie se toma por vía oral para tratamientos analgésicos, anti-inflamatorios, anti-bacterianas y la cicatrización de heridas.

Aims: To isolate compounds from L. aspera with anti-inflammatory and wound healing activities. Methods: The chloroform extract was subjected to a column chromatography on silica gel 60 and their structures were established by spectral analysis (UV, IR, and NMR). The anti-inflammatory activity of the test compounds was evaluated in male albino rats. The acute inflammation was induced by the subplantar administration of 0.1 mL of 1% carrageenan in the right paw. The excision wound model was used to study the rate of wound contraction and the time required for complete epithelization of the injuries in rabbits. Results: A flavonoid apigenin-7-O-(6-O-E-caffeoyl)-β-D–glucopyranoside (1) was isolated from a chloroform fraction of L. aspera. The hydrolysis of compound 1 yield an apigenin (aglycone), caffeic acid and β-Dglucose. Assuming caffeoyl glucose linked to the 7-OH group of apigenin. Conclusions: Compound 1 exhibited a significant anti-inflammatory activity compared with standard diclofenac sodium. The wound healing study revealed that decreased wound area and significant increase in epithelialization in treatment groups was observed.

Keywords: Anti-inflammatory; flavonoids; Leucas aspera; wound healing.

Objetivos: Aislar compuestos de L. aspera con actividades antiinflamatoria y cicatrizante. Métodos: El extracto clorofórmico de L. aspera se sometió a una columna cromatográfica de sílica gel 60 y las estructuras fueron establecidas por análisis espectral (UV, IR y RMN). La actividad anti-inflamatoria de los compuestos estudiados fue evaluada en ratas albinas machos. La inflamación aguda fue inducida por la administración subplantar de 0,1 mL de carragenano 1% en la aponeurosis plantar derecha. El modelo de escisión de la herida fue usado para estudiar la tasa de contracción de la herida y el tiempo requerido para la completa epitelización de las heridas en conejos. Resultados: De la fracción clorofórmica de L. aspera se aisló un flavonoide apigenina-7-O-(6''-O-E-cafeoil)-β-D-glucopiranósido (1). La hidrólisis del compuesto 1 rindió apigenina (aglicona), ácido cafeico y β-D-glucosa. Suponiendo que la cafeoil-glucosa estaba unida al grupo 7-OH de apigenina. Conclusiones: El compuesto 1 exhibió una actividad anti-inflamatoria significativa en comparación con diclofenaco sódico estándar. El estudio de la curación de las heridas reveló que hubo una disminución del área de la herida y un aumento significativo en la epitelización en los grupos de tratamiento. Palabras Clave: Anti-inflamatorio; cicatrización de herida; flavonoides; Leucas aspera.

ARTICLE INFO Received | Recibido: August 5, 2015. Received in revised form | Recibido en forma corregida: November 13, 2015. Accepted | Aceptado: December 7, 2015. Available Online | Publicado en Línea: February 5, 2016. Declaration of interests | Declaración de Intereses: The authors declare no conflict of interest. Funding | Financiación: The authors confirm that the project has not funding or grants. Academic Editor | Editor Académico: Mayank Gangwar.

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Manivannan

L. aspera apigenin glucopyranoside: anti-inflammatory and wound healing activities

INTRODUCTION The herbal remedies traditionally used medicinal plants were increased attention from scientific and pharmaceutical communities Sekhar et al. (2012). Because of this resurgence of interest, the research on plants of medical importance is growing phenomenally in worldwide (Hammer et al., 1999). A review of the literature has revealed that plant metabolite such as alkaloids, flavonoids, among others, play an important role in many of the activities including wound healing, anti-inflammatory, anti-oxidant, and anti-microbial activity (Noor Fathima et al., 2011). Flavonols are of particular interest to phytochemists as shown to have wide bioactive potential and regarded as one of the most numerous and widespread groups of natural polyphenols found in plants (Markham and Geiger, 1994). Inflammation involves the action of the complement system and repair processes. It is both a free-radical generating and free-radical producing process (Miller, 1996). Wounds or any damage to or, break of the skin or underlying tissues. The damage may be caused by accidents, incisions from surgery or other traumas (Ramzi et al., 1994). Medical treatment of wounds includes the administration of drugs either locally or systematically in an attempt to aid wound repair (Savanth and Shah, 1998). Some reports concerning the anti-inflammatory and wound healing activities of various plants have appeared in the literature, but the vast majority has yet to be explored (Rupesh et al., 2011). Leucas aspera L (Labiatae) is a common aromatic herb and grows generously in South India and in the broad area of South Asia. Traditionally, the decoction of the whole plant was taken orally for analgesic, antipyretic, anti-rheumatic, antiinflammatory, anti-bacterial and wound healing treatments, and its paste has been applied topically to inflamed areas (Reddy et al., 1993; Sadhu et al., 2003). The present studies to isolate further flavonoid namely apigenin-7-O-(6-O-E-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside (1), which occurs in chloroform fraction of L. aspera and the prevalence of flavonoids in daily life we decided to find out anti-inflammatory and wound healing activities of plant extracts. http://jppres.com/jppres

MATERIAL AND METHODS Plan material Fresh flowers (3 kg) of L. aspera was collected during the October to March 2012 from the Ariyalur District in Tamil Nadu, India. Dr. N. Ramakrishnan authenticated this species, and voucher specimens (GACBOT-113) were deposited in the Herbarium of the Department of Botany, Government Arts College (Autonomous), Kumbakonam, Bharathidasan University, India. Extraction and isolation Air dried flowers of Leucas aspera (2.35 kg) was extracted with 90% methanol (MeOH) in a Soxhlet apparatus. The hydro-alcoholic solution was concentrated under reduced pressure to dryness, and the residue was dissolved in hot water (1000 mL) and kept in the cold overnight. After filtration, the clear solution was consecutively partitioned with petroleum ether, chloroform and ethyl acetate. In the previous studies (Prabakaran et al., 2013) on L. aspera flowers was reported on the identification of baicalein-7-O-β-D-glucuronide (baicalin) in the ethyl acetate (EtOAc) fraction with EtOAc/MeOH/H2O (98:1:1). In this study was concentrated the chloroform (CHCl3) extract (8.8 g) and was subjected to a column chromatography on silica gel 60 with a gradient of CHCl3-MeOH of increasing polarity and further elution with n-buthanol (BuOH)/acetic acid (AcOH)/H2O (4:1:1) as eluents to yield compound 1 (5.7 g). Acid hydrolysis The compound 1 (10 mg) was refluxed with 5% HCl for 2 h. The hydrolysates were extracted with CHCl3 and held extracts was washed with water, evaporated to dryness and resolved in MeOH. Identification of aglycone, apigenin (Rf: 0.29) (nBuOH/AcOH/H2O (4:1:5, organic phase). The sugars in the aqueous layer were identified by TLC (on silica gel 60) with reliable samples using different solvent system: D-glucose (n-BuOH/AcOH/H2O, 4:1:5; Rf: 0.18) and caffeic acid (EtOAc/formic acid (HCOOH)/water, 80: 10:10; Rf: 0.60). J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 55

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Spectroscopic methods Melting points were determined on a Fisher Scientific melting point apparatus and are uncorrected. A UV spectrum was recorded in MeOH on an Ultraviolet spectrophotometer (UV/VIS 1601, Shimadzu, Japan). The IR spectrum was measured on FT-IR spectrograph (Perkin Elmer Spectrophotometer, USA) with KBr tablets from 4000 to 400 cm−1 with resolution 2 cm−1. 1H and 13C-NMR (500 MHz, CDCl3) spectra was recorded on AMX 500 NMR spectrometer (Bruker Company, Faelladen, Switzerland). Chemical shifts gave in δ (ppm) about TMS as internal standard materials, and the coupling constants (J) are in Hz. Column chromatography was performed on silica gel 60 as stationary phase (particle size 0.04 - 0.036 mm, 230-400 mesh, ASTM E. Merck, Germany) and activated by heating at 110°C for one hour before to use. TLC was carried out on 0.25 mm Brinkman percolated silica gel F254 plates (silica gel 60, 230-400 mesh, Merck, Germany). The different solvent systems were used for TLC analyses (MeOH/EtOAc/H2O, 7:2:1; n-BuOH/Ac-OH/H2O, 4:1:5; EtOAc/MeOH/H2O, 98:1:1; EtO-Ac/HCOOH/H2O; 80:10:10) and the spots were visualized under UV light 365 nm, with NH3 vapors and by spraying with 1% AlCl3 in MeOH. A Shimadzu HPLC system (Columbia, MD), was used with UV detection at 2800 – 350 nm. A chromato-graphic system comprising a Spectra Physics P-200 series gradient pump (Fremont, CA, USA), a rheodyne injector fitted with a 20-FL loop, the C18 column (250 x 4.6 mm, phenomenex, Torrance, CA, USA) was used. Animals Healthy rabbits (New Zealand white rabbits) of both sex and nearly the same age, weighing about 2000 – 2200 g were used in the study. All animals were fed with the standard rodent pellet diet and water ad libitum. They were individually housed, kept in polypropylene cages under normal conditions. “All applicable institutional guidelines for the care and use of animals were followed.” The experimental protocol was subjected to the scrutiny of the Institutional Animal Ethics Committee (IAEC), Bharathidasan University, Trichirappalli, http://jppres.com/jppres

Tamil-nadu, India (Approval BDU/IAEC/2011/31/ 29.03.2011).

No.

Anti-inflammatory activity by carrageenan induced paw edema The anti-inflammatory activity of the test compounds was evaluated in male albino rats (200 250 g). Animals were fasted overnight and divided into control; standard and different test groups, each consisting of six animals at the dose of 100 and 200 mg/kg of test compound 1 and 100 mg/kg diclofenac sodium was administered to the animals by the oral route. Control group animals were received 1% DMSO at the dose of 10 mL/kg body weight. They are housed in cages and kept under standard conditions at 26 ± 2°C and relative humidity 60 - 65%, 12 h lights, and 14 h dark cycles each day for one week before and during the experiments. Acute inflammation was induced by the subplantar administration of 0.1 mL of 1% carrageenan in the right paw. Paw volume was measured by using digital plethysmometer (Ugo BasileItaly) before treatment (V0). One hour after treatment, 0.1 mL of carrageenan was administered into the subcutaneous tissue of the plantar surface of the right hind paw. Then the volume of the paw was taken at 1, 2 and 3 h after carrageenan administration (VT). The efficacy of different treated groups was tested on its ability to inhibit paw edema compared to control group. The edema was expressed as an increase in the volume of the paw (ΔV), and the percentage of inhibition (I %) for each treatment was obtained as follows: Volume of edema (ΔV) = Final Paw Volume (VT) - Initial Paw Volume (V0) The percentage inhibition of paw edema was calculated by the formula: % Inhibition of paw edema = [(VC – VT) / VC] x 100

Where, VC = Paw edema of control group, and VT = Paw edema of treated group.


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Wound healing activity of excision wound model The excision wound model was used to study the rate of wound contraction and the time needed for complete epithelization of the injuries (Nayak et al., 2007). The animals were assigned to four groups each group containing six animals. Group I: No treatment and served as controlled. Group II: Test group with the wound and treated with compound 1 (100 mg/day). Group III: Test group with the wound and treated with compound 1 (200 mg/day). Group IV: Test group with standard drug ointment (soframycin). Animals were anesthetized with slight vapor inhalation of diethyl ether in the pre-determined area and the back of a rabbit was shaved. The excision wound, a circular piece of full thickness sized, nearly 500 mm2 and 2 mm depth was made by cutting out the skin from the shaved area. The test formulation (10% w/w and 20% w/w ointment), standard drug (soframycin ointment) were applied to the wound twice daily, until complete recovery. The progressive changes in wound area were monitored by a camera every fourth day. The changes in the healing of wound were measured and recorded the wound area on graph paper (mm2) every four days until complete wound healing. Wound contraction was determined as a percentage of the decline in the wound area (Werner et al., 1994). % wound contraction = [(initial wound area – specific day wound area) / initial wound area] x 100.

Histopathological examination Small pieces of tissue were isolated from the healed skin of each group of rabbits for histopathological examination (Sadaf et al., 2006). Samples were fixed in 10% buffered formalin, processed and blocked with paraffin wax. Serial sections of 5 μm were prepared and light microscopic study of H&E and Masson’s trichrome stained tissues for routine histopathological evaluation. Masson's trichrome stain was used to find out the degree of collagenization. All slides were examined satisfactorily by the surgical pathologist.


Detection of pH and the protease activity in the wound bed Protease action and activity could be directly pH-dependant (Greener et al., 2005). Elevated protease levels were detected as soon as possible to prevent a wound, ending in a static state of persistent inflammation. However, there are no clinical signs that can specifically identify elevated protease levels in a wound bed. The most often used instrument is a top glass electrode attached to a meter when a probe used it has first calibrated in pH 4 and 7 or 9 buffers. The probe was rinsed with deionized water and then placed flat against the wound for 30 seconds and the result was displayed on the meter. Gel formulation The ointment of compound 1 was prepared by mixing with Vaseline in a concentration of 10% (100 mg compound 1/10 g Vaseline, w/w) and 20% (200 mg compound 1/10 g Vaseline, w/w) respectively. Statistical analysis The experimental results are expressed as multiple comparisons of mean ± SD carried out by oneway analysis of variance (ANOVA) followed by Dunnet Multiple Comparisons Test and statistical significance was defined as p < 0.05.

RESULTS AND DISCUSSION Chemical identification Some preliminary tests started with the crude flower extract of Leucas aspera that on major classes of chemical compounds were present. The chromatographic isolation of L. aspera showed the presence of flavonoid which showed UV absorption characteristic for 7-O-substituted flavone. The main monoglycosidic component baicalein-7-O-βD-glucuronide was isolated and identified from the EtOAc fraction previously (Prabakaran et al., 2013). For further quantitative analyses and pharmacological evaluations of the major chemical compound (1), it was certain to isolate CHCl3 fraction of the flowers


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of L. aspera and to unfold by various methods, including HPLC, UV, IR and NMR-spectroscopy. Compound 1 as a yellow amorphous solid; mp: 238-240°C. This compound also gave positive color reactions for a hydroxyl flavone with several reagents (Kaneta, 1971; Harborne et al., 1975). The UV spectrum λmax (MeOH) showed a band at 270 and 320 nm (sh), deducing its flavanone nature while on the addition of NaOAc showed to occupy the 7th position (Mabry et al., 1970). The addition of NaOAc and AlCl3 pointed to the presence of free hydroxyl at C-4’ and C-5. The IR spectrum displayed characteristic absorption band at 3280 cm-1 for a hydroxyl group and 1690 cm-1 for α, a β-unsaturated carbonyl group, suggesting it flavonoid nature. The IR spectrum also displayed absorption bands for the aromatic ring at 1620 and 1510 cm-1 (Silverstein and Webster, 1998). 1H and 13C spectra presented particular resonance of a glycoside flavone. The 1H NMR spectrum showed aromatic proton signals of two doublets at δ 6.52 and δ 6.63 (each 2H, J= 2.1 Hz) were attributed to the H-6 and H-8 of the A-ring, respectively. The two vicinal coupled doublets at δ 7.42 and δ 6.74 (each 2H, J = 8.8 Hz) was assigned to H-2’/6’ and H-3’/5’ of the B-ring. Also, two singlet signals at δ 12.88 and δ 8.47 which were assigned to 5-chelated OH group and H-3 of isoflavone (Harborne, 1988). However, additional resonances arising from a D-glucose unit with specific signals at δ 5.23 ppm (d, J = 7.3) for anomeric proton and the rest of the sugar protons appear in the range δ 3.30 - 4.32 ppm. Besides the 1H-NMR spectrum also showed an ABX system for 1, 3, 4 - trisubstituted aromatic ring at δH [6.86 (1H, d, J = 3.2 Hz, H-2’’’), 7.82 (1H, d, J = 8.0 Hz, H-5’’’), 6.98 (1H, dd, J = 8.0, 3.2 Hz, H-6’’’)] and two trans-olefinic protons at δH [7.49 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-7’’’), 6.36 (1H, d, J = 15.6 Hz, H-8’’’)] suggesting the presence of caffeoyl group (Chen and Yang, 2007). The 13C-NMR resonance at δC 165.0 ppm was attributed to C-7 and comparing this data with the published value (Markham, 1982; Liu et al., 1998; El-Sayed et.al., 2001) and α, β-unsaturated carbonyl group at δ 181.3 (C-4, C=O), and the olefinic carbons at δ 98.7 (C-6), 165.0 (C-7) of flavone moiety. Also, the 13C-NMR spectrum displayed a chemical shift of the anomeric carbon of β-D-glucose at δ 101.92 and the downfield chemical shift of C-6’’ carbon at δ 62.9 sughttp://jppres.com/jppres

gested that the caffeoyl group is attached to the C6’’ of glucose. On the hydrolysis of 1, yielded an aglycone apigenin, caffeic acid, and β-D-glucose was identified by TLC alongside with positive samples. Since Characteristic 1H and 13C chemical shift values and coupling constant data pointed out the compound 1 were apigenin-7-O-(6’’-O-E-caffeoyl)β-D-glucopyranoside and it was presented in Fig. 1.

Figure 1. Apigenin-7-O-(6’’-O-E-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside.

Anti-inflammatory activity Inflammation is a response of living tissue to injuries that involve activation of various enzymes, mediator release, cell migration, tissue breakdown and repair (Katzung, 2004). Carrageenan-induced hind paw edema is a suitable experimental animal model of acute inflammation (Turner, 1965). Carrageenan induced paw edema takes place in three phases, in the first phase (1 h after carrageenan induce) involves the release of serotonin and histamine from mast cells, in a second phase (2 h) was provided by kinins and the third phase (3 h) was mediated by prostaglandins, the cyclooxygenase and lipoxygenase products (Vinegar et al., 1969). As shown in the results (Table 1), restraint of paw edema (after 3 h) for test compound 1 (100 and 200 mg) with 3.83 ± 0.126 mL and 3.71 ± 0.019 mL paw volume, respectively. It shows the compound 1 had a significant anti-inflammatory effect, and the results were compared with standard diclofenac sodium 100 mg/kg and showed the paw volume reduction of 3.63 ± 0.126 without statistical significance (p > 0.05) between compound 1 and diclofenac sodium. Results were also reported in % restraint of edema (protection against inflammation) after three-hour treatment in comparison with the control group (Table 1). It showed a maximum perJ Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 58

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centage reduction (58.24%) in paw edema at 3 hours. Compound 1 at the dose of 100 and 200 mg/kg body weight showed the percentage of inhibition of paw edema at 4 h 36.26% and 49.45%, respectively. All the test and standard groups have reduced the thickness of edema of the hind paw in different percentages compared to the control group.

Protease activity is a normally recognized part of this process. Proteases are produced by either activated inflammatory cells such as neutrophils and macrophages - these are known as endogenous proteases include collagens, gelatinase, and elastase (Walker et al., 2007; Gibson et al., 2009). Protease action and activity are pH–dependent. All the test groups became basic at pH 7.8 on the 4th day it will reduce to acidic (pH 4.3) on the 12th post wounding day. It is important to state that the results obtained are of surface pH and not tissue pH. Generally, non-healing wounds have a pH level of 8. If the pH level is reduced to a more acidic (approximately 4), the protease activity is decreased by approximately 80% (Greener et al., 2005). A few macrophages and lymphocytes were seen beneath the newly formed epidermis and seen fibrous tissue, which filled the defect in the dermis and surface pH measurement, depended on the elevated protease activity. It is a biochemical marker for predicting the condition of the wound bed. The histopathological examination provided another evidence for the experimental wound healing studies (Fig. 2), which were based on the contraction value of the wound area. This study revealed a significant increase in epithelialization in drug treated group and granuloma showed increases in both the number of growing capillaries and a number of fibroblasts collagenous connective tissue when compared to granuloma of the control animal.

Wound healing activity Also, our research report revealed an excision wounds healing by the recording the changes in the wound are at fixed intervals of time, like 4th, 8th, 12th and 16th days after treating with chloroform extract of L. aspera and reported in Table 2. The groups treated with 15% of ointment base with the soframycin cream were able to effect total wound closure on/before the 12th day of the studies, while the test groups treated with 10% and 20% ointment base effected complete wound closure on the experimental animals on/before the last day of the experiment (day 16). On 16th post wounding day, the period of epithelialization of test compound 1 (100 and 200 mg) were found to be 2 ± 1.10 and 3 ± 1.52 mm2/rabbit, respectively while in a standard group it was significantly reduced to 5 ± 0.69 mm2/rabbit. All readings were considered to be statistically significant (p < 0.05) and comparable to control (Table 2). Also the surface pH measurement to prove compound 1 was better to wound healing activity.

Table 1: Determination of paw volume and % inhibition on carrageenan-induced rats at different time for apigenin-7-O-(6-O-Ecaffeoyl)-β-D-glucopyranoside (1). Dose Treatment

(mg/kg)

Initial paw volume (mL)

Time (h) 1

Inhibition 2

3

(%)

Paw volume (mL ) DMSO 1%

10 (mL/kg)

3.27 ± 0.164

3.66 ± 0.132

3.94 ± 0.241

4.15 ± 0.112

-

Compound 1

100

3.26 ± 0.089

3.48 ± 0.094

3.61 ± 0.115

3.83 ± 0.126

36.26

Compound 1

200

3.27 ± 0.113

3.43 ± 0.067

3.54 ± 0.069

3.71 ± 0.019

49.45

Diclofenac sodium

100

3.27 ± 0.089

3.40 ± 0.094

3.50 ± 0.115

3.63 ± 0.126

58.24

Values are expressed in mean ± standard deviation (n = 6). One-way ANOVA (Dunnett’s method) Means for groups in homogeneous subsets are displayed. There is no significant difference between standard and test drug at p > 0.05 significant level. % Inhibition = at 3rd hour. http://jppres.com/jppres


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Table 2. Effect of oral treatment of apigenin-7-O-(6-O-E-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside (1) on excision wound in rabbits. Dose Treatment

(mg)

Day 0

4th

8th

12th

16th

Wound contraction (mm2/rabbit) Control

0

200 ± 1.05b

173 ± 1.52b

65 ± 1.15b

33 ± 1.02b

11 ± 0.69b

Compound 1

100

200 ± 1.32a

145 ± 1.15a

19 ± 0.40a

10 ± 1.52a

2 ± 1.10a

Compound 1

200

200 ± 0.40a

153 ± 1.29a

21 ± 0.27a

12 ± 1.32a

3 ± 1.52a

Soframycin ointment

100

200 ± 1.32a

160 ± 1.02b

26 ± 1.15a

14 ± 1.15a

5 ± 0.69a

Values are expressed by mean ± standard deviation (n = 6) One-way ANOVA (Dunnett's method) Means for groups in homogeneous subsets are displayed. Subset for alpha = 0.05 level. Different letters symbolize significant differences (p < 0.05).

A

B

C Figure 2. Histopathology of (A) control, (B and C) 100 and 200 mg/kg of compound 1 showing increased epithelialization on 12th day. (H & E stain)



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CONCLUSIONS The present investigation, we confirm that apigenin-7-O-(6’’-O-E-caffeoyl)-β-D-glucopyranoside isolated from chloroform extract of L. aspera was better anti-inflammatory and wound healing activity it was concluded that the test formulation showed better and faster healing as compared to the control group. Bioactive substances from this plant were employed to develop drugs for treating inflammation and wound healing disease. CONFLICT OF INTEREST The authors declare no conflict of interest.

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Supplementary files Isolation of new flavonoid apigenin - 7 - O - (6- O - E - caffeoyl) - β - D - glucopyranoside and evaluation of anti-inflammatory and wound healing activities of Leucas aspera L. *Manivannan Rajamanickam Department of Chemistry, Government Arts College (Autonomous), Kumbakonam, Tamilnadu612001, India

*Correspondence Dr.R.Manivannan, Assistant Professor in Chemistry, Government Arts College (Autonomous), Kumbakonam, Thanjavur (District), Tamilnadu, India - 612001.

HPLC analysis of CHCl3 flower extract of Leucas aspera L

IR spectra of apigenin-7 - O - (6- O - E – caffeoyl) - β - D - glucopyranoside

1H

NMR spectra of apigenin-7 - O - (6- O - E – caffeoyl) - β - D - glucopyranoside

13C

NMR spectra of apigenin-7 - O - (6- O - E – caffeoyl) - β - D – glucopyranoside

0th day

(a)

16th day

0th day

(b)

16th day

0th day

(c)

16th day

0th day

(d)

16th day

Wound healing (a) control, (b & c) 100 & 200 mg/kg of compound 1 (d) standard drug

© 2016 Journal of Pharmacy & Pharmacognosy Research, 4(2), 62-83 ISSN 0719-4250 http://jppres.com/jppres Review | Revisión

Biomarcadores del estrés oxidativo en la terapia antioxidante [Biomarkers of oxidative stress in antioxidant therapy] 1

2

1

Wilfredo Mañon Rossi , Gabino Garrido , Alberto J. Núñez Sellés * 1 Universidad Nacional Evangélica, Paseo de los Periodistas 54, Miraflores, Santo Domingo D.N., República Dominicana. Departamento de Ciencias Farmacéuticas, Facultad de Ciencias, Universidad Católica del Norte, Angamos 0610, Antofagasta, Chile.

2

* E-mail: [email protected]

Abstract

Resumen

Biomarkers are used regularly in medical practice to provide objective markers of health status of a person, as well as the physiological response of the body to a pharmacological therapeutic intervention. In the specific case of the use of antioxidant products (antioxidant therapy), it is necessary to measure both biomarkers of oxidative stress level of the person as those that are specific to a physiological or pathological progression of a disease disorder. This paper describes the main biomarkers of oxidative general and specific stress as well as laboratory techniques, which should be taken into account when measuring the effectiveness of antioxidant therapies.

Los biomarcadores se utilizan de forma regular en la práctica médica para ofrecer marcadores objetivos del estado de salud de una persona, así como de la respuesta fisiológica del organismo a una intervención terapéutica farmacológica. En el caso específico del uso de productos antioxidantes (terapia antioxidante) resulta necesario medir tanto biomarcadores del grado de estrés oxidativo de la persona como de aquellos que son específicos a un desorden fisiológico, patológico o la El presente trabajo describe los progresión de una enfermedad. principales biomarcadores del estrés oxidativo, generales y específicos, así como las técnicas de laboratorio, que deben ser tomados en cuenta a la hora de medir la eficacia de las terapias antioxidantes.

Keywords: Biomarker; human disease; nitrosative stress; oxidative damage; oxidative stress.

Palabras Clave: Biomarcador; daño oxidativo; enfermedad humana; estrés nitrosativo; estrés oxidativo.

ARTICLE INFO Received | Recibido: July 16, 2015. Received in revised form | Recibido en forma corregida: March 27, 2016. Accepted | Aceptado: March 28, 2016. Available Online | Publicado en Línea: March 29, 2016. Declaration of Interests | Declaración de Intereses: The author declares that no conflict of interest exists. Funding | Financiación: Projects FONDOCYT 2012-2013-2A1-58 (República Dominicana) and FONDECYT 1130601 (Chile). Academic Editor | Editor Académico: Edgar Pastene.

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INTRODUCCIÓN Una de las deficiencias que con mayor frecuencia se le han señalado a los estudios clínicos con productos antioxidantes es la inadecuada selección de los marcadores del estrés oxidativo en fluidos biológicos (plasma, sangre, orina, líquido cefaloraquídeo y otros). La mayoría de los estudios publicados han considerado la medición de la concentración del propio producto antioxidante en el fluido biológico, lo cual no ofrece información alguna sobre la intensidad del estrés oxidativo. A partir de finales de la década del 80 se empieza a introducir en la medición del estrés oxidativo un grupo de biomarcadores que, de manera directa o indirecta, brindan información sobre la concentración de diferentes tipos de Especies Reactivas de Oxígeno y Nitrógeno (ERON) en el organismo humano. Incluso se ha llegado a sugerir la existencia de biomarcadores específicos para determinadas enfermedades (Niki, 2014). El uso de biomarcadores de estrés oxidativo surge debido al descubrimiento del incremento del estrés oxidativo en condiciones patológicas. Estos tienen como objetivo desarrollar nuevas estrategias preventivas, diagnósticas y terapéuticas para impedir o demorar la aparición de complicaciones tales como la aterosclerosis y las enfermedades cardiovasculares, entre otras. Los biomarcadores (Biomarkers Definitions Working Group, 2001) ofrecen información sobre tres niveles progresivos de la enfermedad: a) Como parámetros medibles del daño a biomoléculas, tales como lípidos y proteínas; b) Como marcadores funcionales de funciones fisiológicas, por ejemplo, la función cognitiva; c) Como parámetros relacionados a una patología específica. Otros de los objetivos que se persiguen en el desarrollo de un biomarcador son ayudar en el diagnóstico pre-sintomático y sintomático de las enfermedades y ofrecer parámetros que permitan demostrar la eficacia clínica del uso de antioxidantes. La utilidad del biomarcador ideal del estrés oxidativo radica en su capacidad de ofrecer indicaciones tempranas de la enfermedad y su progresión. Un biomarcador del estrés oxidativo http://jppres.com/jppres

Biomarcadores de estrés oxidativo en la terapia antioxidante

aceptable debe ser una entidad química que tenga algunas, o preferiblemente todas, de las características siguientes (Polidori et al., 2001; Lowe, 2014; Shah et al., 2014): a) Resultado de un daño oxidativo severo que pueda relacionarse, de manera inobjetable, con la aparición y progresión de la enfermedad. b) Accesible en un tejido diana o sustituto válido, que refleje la modificación oxidativa en ese tejido, de forma cuantitativa. c) Específico para las ERON bajo estudio y libre de confundirse con factores derivados de la ingestión de alimentos o suplementos nutricionales. d) Tener una concentración adecuada para que sea detectable con las técnicas disponibles de análisis químico de manera específica, sensible, reproducible y robusta. e) Dispersión baja de los valores de concentración; preferiblemente que la variación intra-muestras en el tiempo sea menor que la variación inter-sujetos. f) Estable, no susceptible a la inducción de artefactos o pérdidas durante el manejo, procesamiento, análisis y almacenamiento de las muestras. METODOLOGÍA Para el análisis de la información se emplearon las bases de datos electrónicas PubMed, Scopus y Web of Science como fuentes principales para obtener los artículos relacionados con los biomarcadores y el estrés oxidativo hasta julio de 2015. Las palabras clave utilizadas en la búsqueda fueron: Biomarker, Human Disease, Nitrosative Stress; Oxidative Damage, Oxidative Stress, en sus diferentes combinaciones. Para estructurar y analizar la información se utilizó el gestor bibliográfico Sistema EndNote X4, creándose una base de datos bibliográfica. El análisis y síntesis permitió estudiar la información contenida en los diferentes documentos y resumir sus contenidos a fin de estructurar el presente estudio.


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Biomarcadores del estrés oxidativo Debido a la complejidad de las enfermedades asociadas al estrés oxidativo, es muy improbable que un solo biomarcador del estrés oxidativo sustituya los resultados de un diagnóstico clínico. Por esta razón, el desarrollo de un grupo de biomarcadores es esencial para un diagnóstico o control de progresión más acertado de la enfermedad. Aunque existen técnicas directas para la medición de ERON y otros radicales libres, tales como la Resonancia Paramagnética Electrónica (RPE) (Miura y Ozawa, 2000) y el Método de Atrapamiento de Spin (STM) (Pryoir y Godber, 1991), lo más común en la medición de biomarcadores del estrés oxidativo son las técnicas indirectas, mediante las cuales las ERONs son capturadas por un reactivo adecuado para formar una entidad química estable que posteriormente se analiza por técnicas gasométricas, espectrofotométricas, inmuno-enzimáticas (ELISA) y cromatográficas (Oslowski, 2015). Algunos ejemplos comunes son la hidroxilación del ácido salicílico (Halliwell y Kaur, 1997), el ensayo de la deoxiribosa (Biaglow et al., 1997), el ensayo de reducción del citocromo c para la detección de radicales superóxidos (Kutham et al., 1982) y la detección de radicales del óxido nítrico por compuestos finales coloreados (Amano y Noda, 1995). En la Tabla 1 se muestran algunos ejemplos de biomarcadores de estrés oxidativo y sus métodos de detección. Las técnicas para la cuantificación de biomarcadores del estrés oxidativo son llamadas con frecuencia métodos de fingerprinting (huella dactilar) en los que se miden los productos finales específicos resultantes de la interacción de ERON con macromoléculas biológicas como ADN, proteínas, lípidos y antioxidantes de bajo peso molecular (LMWA, Low Molecular-Weight Antioxidants). La aparición de estos productos finales sirve como prueba de la existencia previa de ERON en las células. Entre los varios sitios de interacción, el ADN, las proteínas y los lípidos son los de mayor importancia. El análisis por HPLC o GC-MS de 8-oxo-2-deoxiguanosina (8-OHdG), después de la hidrólisis enzimática del ADN y la valoración del daño oxidativo por una



electroforesis de célula simple o un ensayo cometa (Fairbarian et al., 1995), son dos de las muchas técnicas utilizadas para detectar modificaciones de bases y aductos al ADN. Otros métodos sirven para determinar rompimientos de simple y doble cadena (Sutherland et al., 2001). Mediante estas técnicas se pueden determinar diferentes aductos oxidados de ADN. Por ejemplo, los aductos aldehídos-ADN, tales como aductos de deoxiguanosina-malondialdehido (Zhang et al., 2002) o los productos finales resultantes de la reacción entre el ADN y el 4-hidroxinonenal, el aldehído que se forma después de la exposición a ERON para generar N2-etenodeoxiguanosina (Sodum y Chung, 1989). La peroxidación lipídica, importante en aterosclerosis, inflamación y funciones mitocondriales, es un proceso complejo que consiste en tres estados: iniciación, propagación y terminación. Para cada estado hay métodos disponibles que permiten cuantificar el avance del proceso y, de esta manera, evidenciar su existencia. Por ejemplo, debido a que la peroxidación lipídica causa pérdida de sustancias, como cadenas de ácidos grasos insaturados, la medición del contenido de lípidos puede indicar peroxidación de estos compuestos. Además, debido a que el oxígeno es consumido durante el estado de propagación, las mediciones de su captación por electrodos de oxígeno puede servir como una herramienta para evaluar el progreso de la oxidación (Lowe, 2014). Otro enfoque consiste en la medición de la formación de peróxido durante el proceso. Entre los muchos métodos desarrollados para ese propósito, algunos determinan la concentración de peróxido total, mientras que otros determinan la concentración de peróxido, lo que puede indicar que el ácido graso sufre el proceso del peroxidación. Mediante la sustracción de un hidrógeno por una ERON ocurre una reestructuración del ácido graso, dando lugar a un radical libre que se caracteriza por la formación de un dieno conjugado (Halliwell y Gutteridge, 1999), el cual se puede monitorear fácilmente por métodos espectroscópicos.


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Biomarcadores de estrés oxidativo en la terapia antioxidante Tabla 1. Biomarcadores de estrés oxidativo y sus métodos de detección

Tipo de medición

Marcadores

Electron spin Espectroscopía

ERO Medición directa

Lípido

ERON Medición indirecta Proteína

ADN

Antioxidante

Antioxidantes no enzimáticos

Capacidad antioxidante

resonance

(ESR)

–

Fluorescencia (2′,7′ diclorofluoresceína) – Citometría de flujo-espectrofluorometría Ion electrode method

ERN

Actividad de enzimas antioxidantes

Pruebas y métodos de detección

a) Malonildialdehido (MDA)

Colorimétrico, HPLC

b) Sustancias reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS)

Colorimétrico, fluorométrico

c) 4-Hidroxinonenal (HNE)

GC-MS, HPLC

d) F2 isoprostanos (8-iso-PGF2)

Colorimétrico, fluorométrico, ELISA

e) Hidroperoxidación lipídica Hexanoil-Lys aducto (HEL)

ELISA, HPLC

f) Lipoproteína de baja densidad oxidada

HPLC, ELISA

a) Carbonilo

Colorimétrico, ELISA

b) 3-Nitrotirosina

GC-MS, HPLC, ELISA

c) Tiolproteina


a) 8-Hidroxi-2′deoxiguanosina (8-OHdG)

HPLC, LC, MC, ELISA

b) Ruptura del ADN

Ensayo Cometa, citometría de flujo

Superóxido dismutasa, glutatión peroxidasa, catalasa, glutatión reductasa, xantina oxidasa


Glutatión

Colorimétrico, fluorométrico, HPLC

Ácido ascórbico, α tocoferol, β caroteno, licopeno

Colorimétrico

Zn, Se, Mn, Cu, Fe

Fotometría de llama

a) Total Antioxidant Status (TAS)

Colorimétrico

b) Trolox Equivalent Antioxidant Capacity (TEAC)

Colorimétrico

c) Ferric Reducing Antioxidant Power (FRAP)

Colorimétrico

d) Asymmetric Dimethylarginie (ADMA)

Colorimétrico

fluorométrico,

ELISA,

Modificado de Shah et al. (2014). ERO: Especies reactivas del oxígeno; ERN: Especies reactivas del nitrógeno.



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En el último estado del proceso de peroxidación, los peróxidos son descompuestos a aldehídos como el malonildialdehído (MDA), el que puede detectarse por reacción colorimétrica con el ácido tiobarbitúrico. También pueden evaluarse los productos finales de otros aldehídos como el hexanal, Todas ellas son llamadas especies reactivas del ácido tiobarbitúrico (TBARS, Thiobarbituric Acid Reactive Substances) (Esterbauer, 1996). Este método es uno de los más ampliamente usados para detectar la peroxidación en todo el organismo. La evidencia del proceso de peroxidación en animales y humanos puede ser obtenida a través de la medición de gases de hidrocarburos, como el pentano y el etano que se forman como productos finales de la peroxidación. Estos gases pueden detectarse en la respiración de las especies ensayadas con el uso de la cromatografía gaseosa. También sirven como marcadores de estrés oxidativo las mediciones de emisión por quimioluminescencia de bajo nivel (Albertini y Abuja, 1998) y de fluorescencia, que emanan de los pigmentos producidos de la interacción de aldehídos (por ejemplo, MDA) con grupos aminos laterales de cadenas de proteínas, aminoácidos o de las bases de los ácidos nucleicos para formar bases de Schiff (Hammer y Braun, 1988). La evaluación del daño oxidativo a proteínas puede lograrse mediante el uso del ensayo del carbonilo (Levine et al., 2000). Los grupos carbonilo (>C=O) son producidos por el ataque de las ERON sobre los residuos de aminoácidos en las proteínas. Entre esos métodos se incluyen la estimación del total de grupos carbonilo, la que constituye una determinación específica de técnicas de electroforesis en gel, así como determinaciones de peróxidos, pérdida de grupos sulfhidrilo (SH), pérdida de fluorescencia (por ejemplo, triptófano), clorinación de proteínas, nitración de proteínas e hidroxilación de aminoácidos. Técnicas analíticas para biomarcadores del estrés oxidativo Existen muchos métodos para evaluar la actividad y composición de las enzimas antioxidantes que, junto con los LMWA, constituyen los dos componentes mayoritarios del sistema endógeno de defensa antioxidante. http://jppres.com/jppres


Algunas técnicas que directamente evalúan actividad enzimática utilizan medidas espectroscópicas, procedimientos de actividad en gel o métodos de inmunocitoquímica (Tabla 1). La determinación del destino de LMWA sirve como un indicador de la existencia de las ERON. Por ejemplo, el ataque de una ERON sobre el ácido úrico conduce a la producción de alantoína (Halliwell y Gutteridge, 1999); de forma similar, el ataque de esta sobre el ácido ascórbico causa una producción de ácido dehidroascórbico. La determinación de la relación entre el oxidante y el reductor (por ejemplo, ascorbato-dehidroascórbico o glutatión reducido-glutatión oxidado (GSHGSSG) es un indicador de daño oxidativo. Uno de los enfoques más comúnmente usados es la medición de la actividad antioxidante total de un sitio biológico. La pérdida de una molécula antioxidante causa cambios en la concentración de otras moléculas antioxidantes y puede evaluarse mediante varias técnicas bioquímicas, inmunohistológicas, espectroscópicas y electroquímicas (Prior y Cao, 1999). El ensayo de Actividad Antioxidante Total (TAS, Total Antioxidant Status) ofrece muchas ventajas y es considerada una herramienta útil como marcador del estrés oxidativo en fluidos corporales y tejidos. Es también utilizado como una herramienta apropiada para la evaluación de la terapia antioxidante. Las determinaciones de LMWA total, más que antioxidantes individuales, son importantes porque los LMWA trabajan en conjunto (Berry y Kohen, 1999) y la medición de sólo uno o unos pocos compuestos, de los muchos presentes en un lugar específico, puede ser errónea. Existe una docena de LMWA y usualmente sólo unos pocos de ellos son conocidos, como la vitamina E y los ácidos ascórbico y úrico. Existen numerosos procedimientos que permiten medir la actividad de LMWA total e incluyen métodos directos e indirectos para calcular la actividad antioxidante total que se origina a partir de ellos (Lowe, 2014). Los métodos directos para medir los LMWA totales son aquellos que utilizan una prueba externa para determinar la capacidad oxidante o reductora de un sistema. Un ejemplo de ello lo constituye un electrodo, en el cual la corriente es J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 66

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proporcional a la concentración del secuestrador de la pareja redox bajo investigación. Estos métodos directos se clasifican en dos grupos: químicos y electroquímicos. Los métodos químicos miden la pareja redox activa cuyo estado oxidado o reducido tiene diferentes propiedades físicas que se miden como una función de la concentración. Por ejemplo, el ensayo del poder antioxidante para reducir el hierro III (FRAP, Ferric-Reducing Antioxidant Power) se basa en la reacción en la muestra de la pareja redox hierro II-III con antioxidantes, manifestado con un color azul que se mide a 593 nm (Benzie y Strain, 1999). Los métodos electroquímicos incluyen varias técnicas, tales como la potenciometría, la titración electroquímica y la voltametría (Skoog et al., 1988). Tales mediciones pueden realizarse de forma fácil y rápida y pueden involucrar varias muestras sin extracción y tratamiento sofisticados. Es importante señalar que la información derivada de estos ensayos no se puede obtener por otros métodos y las evaluaciones proveen información de todos los LMWA, tanto de naturaleza lipofílica como hidrofílica, y se obtiene en células, fluidos biológicos y tejidos. Los métodos indirectos son, entre otros, los siguientes: a. Medición de parejas electroquímicas, tales como GSH-GSSG, NADH-NAD, y ácido ascórbico-ascorbato; b. El ensayo de la capacidad antioxidante equivalente de Trolox (TEAC, Trolox Equivalent Antioxidant Capacity) (Motchnik et al., 1994); c. El ensayo del potencial atrapador de radical (TRAP, Total Radical-Trapping Potential) (Rice-Evans y Miller, 1994); d. El método de quimioluminiscencia; e. La metodología de la capacidad de absorbancia oxígeno-radical (ORAC, OxygenRadical Absorbance Capacity) (Prior y Cao, 1999). La metodología para la cuantificación de LMWA totales fue la primera en introducirse (Lissi et al., 1995) y se ha usado en una amplia variedad de situaciones clínicas y desórdenes patológicos que http://jppres.com/jppres


incluyen diabetes, colitis ulcerativa, enfermedades neurodegenerativas, el estado de la piel y las patologías asociadas a esta y la terapia de irradiación; así como el estudio de los procesos de envejecimiento y el desarrollo embrionario (Kohen et al., 1992¸Lissi et al., 1995). También se ha comprobado que los fluidos biológicos, tales como fluido seminal, saliva, sudor, orina, plasma y jugo gástrico poseen poder reductor derivado del contenido de sus LMWA. Las pruebas fluorescentes se vienen utilizando con mayor frecuencia para determinar la presencia de ERO y ERN (Kalyanaraman et al., 2012). Sin embargo, estas pruebas no son específicas y la respuesta puede ser interferida por componentes biológicos celulares que pueden conducir a resultados que no reflejan la severidad del estrés oxidativo (Winterburn, 2014). Las sondas cuánticas semiconductoras fluorescentes han demostrado que pueden eliminar esta desventaja de las pruebas fluorescentes tradicionales (Adegoke y Forbes, 2015). La determinación del estado del estrés oxidativo (leve, moderado o severo), de acuerdo a los marcadores del estrés oxidativo que se miden, se divide en tres categorías: a) Moléculas modificadas por radicales libres, tales como el 4-HNE, MDA y 8-OHdG, que son derivados de proteínas, lípidos y ácidos nucleicos, respectivamente. La cantidad de estos productos es proporcional a la dosis de la ERON tóxica y son detectados en los sitios donde ocurre el ataque de la ERON. b) Enzimas y moléculas antioxidantes que están asociadas con el metabolismo de ERON, tales como GSH y catalasa. c) Factores transcripcionales, tales como el factor de transcripción nuclear κB (NF-κB) y c-myc, los cuales son modulados por ERON. Biomarcadores específicos del estrés oxidativo Muchas publicaciones refieren biomarcadores del estrés oxidativo dirigidos a enzimas específicas, factores o productos de daño que son usados para soportar la investigación de la fisiopatología de enfermedades tóxicas o neurodegenerativas (como el cáncer) o son aplicados al desarrollo de nuevos J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 67

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fármacos. A continuación se relacionan algunos de estos biomarcadores: • 8-Hidroxideoxiguanosina (8-OHdG): La 8OHdG es una forma oxidada de la guanina y es considerada como el mayor inductor de daño oxidativo al ADN; causa mutaciones de transversión de A:T a C:C o G:C a T:A, debido a su apareamiento con adenina o citosina (Kohen y Nyska, 2002; Kroese y Scheffer, 2014). Sin embargo, la importancia biológica de las concentraciones elevadas de 8-OHdG urinaria ha estado abierta al debate. Por un lado, estas concentraciones elevadas podrían implicar una mayor exposición a ERON, mientras que por el otro, podría indicar la presencia de un sistema de reparación completa del ADN que ha sido capaz de mitigar el daño potencial. Por lo tanto, la interpretación de los datos de biomarcadores es fundamental para la comprensión de los complejos procesos que tienen lugar dentro de una célula-tejido y, a menudo, implica más estudios mecanicistas para ayudar con la interpretación de los valores detectados (Laher, 2014). • Oxidación de tirosina, nitración y halogenación: El análisis de 3-nitrotirosina (NO2-Tyr), un marcador estable de oxidantes derivados del óxido nítrico (NO) (Dalle-Donne et al., 2006), y productos halogenados de tirosina, como la 3-clorotirosina (Cl-Tyr) y la 3-bromotirosina, han sido llevados a cabo en varias enfermedades por métodos diversos. La determinación cuantitativa de NO2-Tyr presenta varios problemas metodológicos que han sido criticados de forma exhaustiva (Toyokuni, 1999; Davis et al., 2001), ya que la mayoría de los datos disponibles en tejidos y fluidos han sido derivados de métodos basados en anticuerpos, los que usualmente no han sido rigurosamente validados. Además, la concentración de NO2-Tyr encontrada en muestras de plasma humano normal varían hasta 30 veces entre diferentes estudios. Una posible razón es que la NO2Tyr puede generarse rápidamente ex vivo durante la preparación de la muestra y el http://jppres.com/jppres


análisis se realiza como resultado de la acidificación o contribución de enzimas proteolíticas por autodigestión. Otro biomarcador para uso humano pudiera ser la O,O’-ditirosina (Di-Tyr), que aparentemente no se metaboliza y también es detectable en la orina humana. Su concentración en la orina podría, por tanto, servir como un marcador no invasivo de la oxidación de proteínas. Por otra parte, Di-Tyr tiene la ventaja de ser metabólicamente estable porque, una vez que el enlace 3’-3’ carbonocarbono está formado, sólo se libera después de la hidrólisis enzimática de las proteínas modificadas en el proceso oxidativo (DalleDonne et al., 2006). • Malonildialdehído (MDA): El MDA es un cetoaldehído fisiológico producido por descomposición de lípidos insaturados provenientes del metabolismo del ácido araquidónico. El exceso de MDA producido como resultado del daño tisular puede combinarse con grupos aminos de proteínas (este reacciona fundamentalmente con residuos de lisina por la reacción de adición de Michael) lo que produce aductos de proteínas modificadas. Estas modificaciones son inmunogénicas y se han detectado autoanticuerpos contra residuos de lisina modificados por MDA en suero de conejos y humanos. Estos auto-anticuerpos se han relacionado con la aterosclerósis, insuficiencia arterial coronaria y el infarto de miocardio (Tsikas et al., 2005). La relevancia clínica de la reacción que ocurre entre el MDA y las proteínas es medible en una serie de enfermedades de alta morbi-mortalidad. • Acroleina (2-propenal): La acroleína está presente en varias fuentes ambientales, principalmente el humo del cigarro. Uno de sus derivados 4-hidroxi-2-nonenal (HNE) es el aldehído de mayor toxicidad generado por el ataque de ERON sobre ácidos grasos ω-6poli-insaturados (ácidos araquidónico, linoleico y linolénico) (Duncan, 2003) y es considerado un segundo mensajero tóxico de ERON (Stocker y Keaney, 2004; Tsikas y Caidahl, J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 68

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HNE experimenta varias reacciones con proteínas, péptidos, fosfolípidos y ácidos nucleicos y tiene una actividad biológica alta, por lo que exhibe numerosos efectos citotóxicos, mutagénicos y genotóxicos. Ello incluye la inhibición de la síntesis de proteínas y ADN, inactivación de enzimas, estimulación de fosfolipasa C, reducción de la comunicación gap-junction, estimulación de la quimiotaxis de neutrófilos, modulación de la agregación plaquetaria y de la expresión de varios genes (Uchida, 2003). HNE puede ser un mediador de la apoptosis inducida por el estrés oxidativo, la proliferación celular y las vías de señalización (Kilgour y Roberts, 2014). HNE se forma permanentemente a concentraciones basales bajo condiciones fisiológicas, pero su producción se aumenta rápidamente en condiciones patológicas relacionadas con un incremento de la peroxidación lipídica. HNE y acroleína son altamente reactivos frente a proteínas (en particular, HNE es mucho más reactivo frente a proteínas que a ADN). Estos forman aductos covalentes con residuos de histidina, lisina y cisterna, a través de la reacción de adición de Michael, los que se conocen con el nombre de productos finales avanzados de lipoperoxidación (Winczura et al., 2012). • Isoprostanos: Los F2-Isoprostanos (F2-IsoPs) son moléculas que contienen un anillo de prostano tipo F que, teóricamente, son una familia de compuestos similares a la prostaglandina F2α. Estos son generados in vivo, primeramente in situ, por peroxidación no enzimática catalizada por radicales libres provenientes del ácido araquidónico esterificado y después liberados a la circulación por fosfolipasas antes de la excreción en orina como isoprostanos libres. Los F2-IsoPs es la clase de isoprostanos más estudiada y debido a su estabilidad ofrecen una medida muy exacta del estrés oxidativo. Varios reportes muestran que los F2-IsoP son biomarcadores de la peroxidación lipídica, auténticos y fiables, útiles in vivo como biomarcadores del estrés oxidativo en varias condiciones clínicas que se resumen en la http://jppres.com/jppres


Tabla 2. También los F2-IsoPs se usan para ensayar la respuesta oxidativa in vivo de varios fármacos, antioxidantes o en intervenciones dietéticas en las que se prueben sus propiedades secuestradoras de ERON (Parola et al., 1999; Carini et al., 2004). Los isoPs se encuentran en cantidades medibles en muchos fluidos biológicos como plasma, orina, fluido sinovial, fluido broncoalveolar, bilis, linfa, fluido de microdiálisis de varios órganos y fluido amniótico, pericárdico y seminal. Las muestras de plasma y orina son las que más se analizan por la ventaja de que los métodos para su obtención son menos invasivos (Lowe, 2014). La cuantificación de F2IsoPs en esos fluidos da un índice de elevada exactitud y precisión de la severidad del estrés oxidativo, aunque su medición es aún complicada (van't Erve et al., 2015). • Factor de transcripción nuclear κB (NF-κB): El NF-κB es un factor transcripcional implicado en la inflamación y la activación del sistema inmune y es activado por agentes oxidantes y citocinas, entre otros (Butterfield, 2002). Este factor está preparado, de forma particular, para la defensa en aquellas condiciones que atenten contra la vida (infecciones virales y bacterianas o estrés físico) y realiza semejante función porque se encuentra en el citoplasma de casi todas las células. En el tejido inflamado de forma crónica, en el que los estímulos patogénicos externos parecen estar ausentes, TNF e IL-1 actúan como inductores endógenos primarios de NF-κB. Cuando las células son expuestas a estas citocinas, una cascada de eventos conduce a la fosforilación y subsecuente degradación de sus inhibidores, por lo que NF-κB se libera para entrar en el núcleo y activar la expresión de genes (Janssen, 2001). Esta activación del factor incrementa la expresión de moléculas de adhesión Eselectina, VCAM-1 e ICAM-1, mientras la inhibición de NF-κB reduce la adhesión y transmigración de leucocitos. También su activación está involucrada en la inducción o inhibición de la apoptosis (González-Murillo et al., 2015). NF-κB es activado, de forma J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 69

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significativa, en sitios de inflamación en diversas enfermedades y puede inducir la transcripción de citocinas proinflamatorias, tales como TNFα, IL-1β, IL-6 e IL-8, quimiocinas, moléculas de adhesión, metaloproteinasas de la matriz (MMPs), COX-2 y iNOS. En artritis reumatoide, NF-κB es sobre-expresado en la membrana sinovial inflamada y su actividad puede aumentar el reclutamiento de células inflamatorias y la producción de mediadores proinflamatorios tales como IL-1, IL-6, IL-8, y TNFα (Montine et al., 2005; Morrow, 2005; Fulop et al., 2015). • Ciclooxigenasa-2 (COX-2): La COX-2 es inducida en el sitio de inflamación después de la estimulación con agentes proinflamatorios como IL-1, TNFα y lipopolisacárido (LPS) (Karin y Ben-Neriah, 2000). Algunas investigaciones sugieren que la liberación desde células inflamatorias de NO.; el cual es sintetizado a partir de Larginina por la acción de la iNOS, incrementa la actividad de COX-2. La sobre-expresión de COX-2 está involucrada en la proliferación celular y la carcinogénesis en diferentes órganos (Baldwin, 1996). Además, inhibidores específicos de COX-2 previenen la carcinogénesis de pulmón (Miagkov et al., 1998; Fulop et al., 2015). • Glutatión y proteínas S-glutationiladas: Debido a que las concentraciones sanguíneas de glutatión reflejan el estado del glutatión en otros tejidos menos accesibles, las mediciones del glutatión reducido (GSH) y el glutatión disulfuro (GSSG) en sangre se consideran esenciales como índice del estado del GSH en todo el cuerpo y es un indicador útil del estado de estrés oxidativo en humanos (Han et al., 1998; Montezano et al., 2015). • Glutatión S-transferasa: Las enzimas que metabolizan fármacos, como las glutatión Stransferasas (GST), y los sistemas antioxidantes, como glutatión, vitaminas, catalasa y superóxido dismutasa, funcionan concertadamente como los dos mayores sistemas de defensa inducibles contra electrófilos y xenobióticos (Aupperle et al., 1999). http://jppres.com/jppres


La expresión de estos dos sistemas ocurre a través de una región reguladora común llamada elemento de respuesta antioxidante (ARE, Antioxidant Responsive Element) (Dubois et al., 1998). Se sabe que el factor nuclear 2 (Nrf2) es la molécula clave que responde a los electrófilos reactivos por activación de la expresión de genes mediada por ARE. La glutatión S-transferasa-pi (GSTpi), un miembro de esta familia de enzimas de fase II de detoxificación, cataliza la reacción de detoxificación intracelular, en la que se incluye la inactivación de carcinógenos electrofílicos (Zimmermann et al., 1999; Fletcher et al., 2015). • Óxido nítrico sintasa inducible (iNOS): La iNOS ha sido detectada en células del sistema inmune como macrófagos, neutrófilos, células musculares lisas, queratinocitos, células mesengliales, hepatocitos, fibroblastos y miocitos cardíacos, entre otros (Rioux y Castonguay, 1998). Esta enzima produce NO en cantidades mil veces superiores a las formadas por el sistema constitutivo. En muchos estudios se ha obtenido como resultado que el NO liberado por la estimulación del sistema inducible causa profunda vasodilatación, daño celular y disfunción cardiaca. Se ha comprobado su participación en mecanismos defensivos del organismo contra las células tumorales y contra infecciones provocadas por bacterias, hongos, parásitos intracelulares y determinados virus. Esto puede realizarlo debido a la acción citostática y citotóxica que ha sido comprobada para dicho radical (Pastore et al., 2003). En el choque endotóxico producido por LPS, la inducción que se produce de la iNOS está precedida de un aumento en la síntesis del TNFα y se ha demostrado que la conexión existente entre la estimulación (administración de LPS) y el posterior incremento en la síntesis del TNFα, no es más que un proceso mediado por la producción de NO (Enomoto et al., 2001). Aunque las otras isoformas de la NOS están involucradas, en mayor o menor grado, en el proceso inflamatorio, el papel que J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 70

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desempeña la iNOS parece ser dominante. La expresión de la iNOS, después de la estimulación por endotoxina bacteriana u otras citocinas, está acompañada por la liberación de otros mediadores, tales como PGE2 y PGI2, vía COX (Prestera y Talalay, 1995). La producción sinérgica de PGs y NO parece tener un vínculo crucial entre las vías de NOS y COX en ciertas condiciones patológicas. La activación celular por componentes de la pared celular de bacterias Gram-positivas o -negativas resulta en la producción de una variedad de mediadores inflamatorios que son esenciales para el desarrollo del choque séptico y sus complicaciones (Henderson et al., 1998). Aunque la expresión de iNOS protege el hígado en la inflamación hepática aguda, esta puede producir necrosis hepática en la isquemiareperfusión y en el choque hemorrágico (Balligand et al., 1994). Se ha demostrado in vitro que el NF-κB desempeña un papel fundamental en la regulación transcripcional de los genes, humano y murino, de la iNOS activados por LPS y citocinas (Moncada, 1992). El NO estimula la producción del TNFα en sinoviocitos y condrocitos lo que promueve la degradación del cartílago articular, implicada en ciertas enfermedades reumáticas y lupus eritematoso (Rojas et al., 1993). También ha sido estudiada su influencia en dermatitis (Salvemini et al., 1996), diabetes (Groeneveld et al., 1997), arteriosclerosis (Li y Billiar, 1999), asma (Taylor et al., 1998), cicatrización (Clancy et al., 1998) y la enfermedad inflamatoria intestinal (Clough, 1999), entre otras (Shah et al., 2014). • Hemooxigenasa I (HO-1): La HO-1 es una proteína de choque térmico y la principal enzima implicada en el catabolismo del grupo hemo. HO-1 fue descubierta a principios de la década del 60 del siglo XX, pero no fue hasta mediados de los años 80 cuando empezó a estudiarse con detenimiento y se comprobó que existía una isoforma inducible, la cual fue denominada HO-1. Esta proteína desempeña un papel importante en la modulación de procesos http://jppres.com/jppres


inflamatorios, demostrado en diferentes modelos experimentales, tanto en animales como humanos, en los mecanismos de defensa antioxidante endógenos ante la presencia de algún daño y en el bloqueo de los procesos apoptóticos, donde han sido involucradas distintas rutas de señalización celular (Sánchez et al., 2005; Fredenburgh et al., 2015). • Proteínas carboniladas: Los grupos carbonilo de las proteínas se generan por oxidación de varias cadenas de aminoácidos, por la formación de aductos de la reacción de Michael entre residuos de lisina, histidina y cisteína y aldehídos α,β-insaturados, así como por glicosidación/glicoxidación de grupos amino de lisina que forman productos finales avanzados de glicosidación (Maxwell y Cooke, 1999). La formación de compuestos carbonílicos es el marcador más general y ampliamente usado para la comprobación de oxidación severa de proteínas tanto in vitro como in vivo. Se han desarrollado varios ensayos para la cuantificación de estas especies (Sanders, 1999; Schaffer et al., 1999). La estabilidad química de las proteínas carbonílicas las hacen un blanco muy conveniente para las mediciones del daño oxidativo en el laboratorio. Se ha comprobado que los grupos carbonilo pueden desempeñarse como marcador de daño oxidativo a proteínas en el envejecimiento y una serie larga de enfermedades (Tetik et al., 2015). • Glicol timidina: La oxidación de timidina por el radical hidroxilo genera 5,6-dihidroxi-5,6dihidrotimidina (glicol timidina). Generalmente, la mayoría de los productos de timidina no generan lesiones premutagénicas potentes; sin embargo, la glicol timidina en particular distorsiona la molécula de ADN, que conduce a una lesión letal (Lowe, 2014). • Daño oxidativo al ADN: El daño al ADN celular es causado por ERON generadas bajo diferentes condiciones y este se relaciona con el riesgo incrementado del desarrollo de J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 71

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cáncer (Leonard et al., 1998). El ADN sujeto al ataque del radical hidroxilo genera un amplio rango de productos de modificación de azúcares y bases (Ferris et al., 1999; Fang et al., 2004). Tales productos pueden medirse por técnicas basadas en anticuerpos y HPLC, GCMS y LC-MS. Usualmente, se miden 8-OHdG (Dalle-Donne et al., 2003) y glicol timidina (Lowe, 2014) como índice de daño oxidativo al ADN. Una técnica específica, para identificar las especies reactivas que se forman a partir del ataque de radicales libres contra la

molécula del ADN, es la del Atrapamiento de Inmuno Spin (Immune Spin Trapping: ISP). Esta práctica combina la sensibilidad del atrapamiento de spin con los métodos de inmunoensayo para detectar el daño provocado por el estrés oxidativo en la molécula de ADN (Ramirez et al., 2006; 2007). En la Tabla 2 se aprecia un resumen de algunas de las enfermedades que están asociadas con un incremento del estrés oxidativo sobre la base de la determinación de los biomarcadores del estrés oxidativo descritos con anterioridad.

Tabla 2. Principales biomarcadores para determinar la intensidad del daño oxidativo en relación a la progresión de diferentes enfermedades asociadas con un incremento del estrés oxidativo. Enfermedad

Biomarcador del estrés oxidativo

Referencia

Angina

F2-IsoPs, MDA

Dalle-Donne et al., 2006; Ito et al., 2015.

Aterosclerosis

MDA, HNE, F2-IsoPs, NO2-Tyr, Cl-Tyr, Di-Tyr, HO-1, NF-κB, COX-2, 8-OHdG, NADPH oxidase

Sengupta, 1999; Baldwin, 2001; Turini y DuBois, 2002; Sánchez et al., 2005; Dalle-Donne et al., 2006; Gray et al., 2013; Kroese y Scheffer, 2014.

Hipercolesterolemia

F2-IsoPs, NO2-Tyr

Dalle-Donne et al., 2006.

Hiperlipidemia

Proteínas S-glutationadas


Daño por isquemia-reperfusión

F2-IsoPs, HO-1

Sánchez et al., 2005; DalleDonne et al., 2006.

Enfermedad arterial coronaria

F2-IsoPs, NO2-Tyr, Cl-Tyr, 8-OHdG

Dalle-Donne et al., 2006; Zhang, 2013; Kroese y Scheffer, 2014.

Enfermedades cardiovasculares

Marczin et al., 2003; DalleHNE, F2-IsoPs, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, Cl-Tyr, NF-κB, 8-OHdG, Donne et al., 2006; Zhang, 2013; Kroese y Scheffer, HO-1

Sistema cardiovascular

2014; Fredenburgh et al., 2015.

Infarto del miocardio

F2-IsoPs, HO-1, COX-2, 8-OHdG

Sengupta, 1999; Sánchez et al., 2005; Dalle-Donne et al., 2006; Kroese y Scheffer, 2014.

Inflamación miocárdica

NO2-Tyr


Insuficiencia cardiaca

F2-IsoPs, 8-OHdG

Dalle-Donne et al., 2006; Kroese y Scheffer, 2014.

Hipertensión

HO-1, radical superóxido, H2O2, SOD, CAT, GSH, NADPH oxidasa, MDA, F2-IsoPs,

Sánchez et al., 2005; Fredenburgh et al., 2015; Montezano et al., 2015.

Agregación plaquetaria

HO-1

Sánchez et al., 2005.



Mañon Rossi et al.


Continuación Tabla 2…

Enfermedad


Referencia

Daño vascular

HO-1


Enfermedades inflamatorias intestinales

HO-1 , NF-κB, COX-2

Sengupta, 1999; Baldwin, 2001; Sánchez et al., 2005.

Isquemia-reperfusión intestinal

HO-1


Enfermedad de Crohn

F2-IsoPs, NO2-Tyr, Proteínas carboniladas


Isquemia intestinal

HO-1


Enfermedad hepática alcohólica aguda y crónica

F2-IsoPs, decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG


Hepatotoxicidad

HO-1


Perfusión hepática

HO-1


Choque hepático

HO-1


Función hepatobiliar

HO-1


Isquemia-reperfusión hepática

HO-1


Cirrosis

F2-IsoPs (biliar primaria) y hepática, NO2-Tyr, proteínas carboniladas, GSH, GSH:GSSG, GPx, MDA

Dalle-Donne et al., 2006; Gimenez-Garzó et al., 2015.

Artritis

Proteínas carboniladas (artritis crónica juvenil), (artritis reumatoide, psoriática y reactiva), Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, , Cl-Tyr, Proteínas carboniladas , NF-κB, NO, COX-2 (artritis reumatoide)

Sengupta, 1999; Li et al., 2000; Baldwin, 2001; Turini y DuBois, 2002; BlancoGarcía et al., 2005; DalleDonne et al., 2006.

Esclerosis lateral amiotrófica

MDA, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, Proteínas carboniladas


Esclerosis múltiple

F2-IsoPs, NO2-Tyr, MDA

Dalle-Donne et al., 2006; Miller et al., 2013.

Esclerosis sistémica (esclerodermia)

F2-IsoPs


Fibrosis quística

F2-IsoPs, NO2-Tyr, Cl-Tyr, Di-Tyr, proteínas carboniladas


Lupus eritematoso sistémico

F2-IsoPs, NO2-Tyr, HNE, proteínas carboniladas, MDA, Dalle-Donne et al., 2006; Shah et al., 2014. 8-OHdG, GPx, GR

Osteoartritis

F2-IsoPs, NO2-Tyr, NO

Sistema digestivo

Hígado

Enfermedades autoinmunes


Blanco-García et al., 2005; Dalle-Donne et al., 2006.


Mañon Rossi et al.



Enfermedad


Referencia

Osteoporosis

F2-IsoPs, COX-2

Turini y DuBois, 2002; Dalle-Donne et al., 2006.

Psoriasis

Proteínas carboniladas, NO

Dalle-Donne et al., 2006; Namazi, 2006.

Síndrome de fatiga crónica

Proteínas carboniladas, 8-OHdG; MDA, HO-1

Dalle-Donne et al., 2006; Maes et al., 2009; Jammes et al., 2012; Fredenburgh et al., 2015.

Infecciones por micro-organismos Hepatitis C crónica

Proteínas carboniladas, NO, 8-OHdG

Maeda y Akaike, 1998; Dalle-Donne et al., 2006; Lowe, 2014.

Hepatitis B crónica

8-OHdG

Lowe, 2014.

Carcinoma hepatocelular

8-OHdG

Lowe, 2014.

Infección e inflamación por Helicobacter pylori

Proteínas carboniladas


VIH

Proteínas S-glutationadas, HO-1, NO, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NF-κB

Maeda y Akaike, 1998; Baldwin, 2001; Sánchez et al., 2005; Dalle-Donne et al., 2006.

Leishmaniasis cutánea

MDA


Meningitis



Miocarditis autoinmune aguda



Pancreatitis

F2-IsoPs, Proteínas carboniladas


Sepsis

Proteínas carboniladas, NF-κB, NO

Maeda y Akaike, 1998; Baldwin, 2001; DalleDonne et al., 2006. Sánchez et al., 2005.

Sistema inmune Enfermedades autoinmunes

HO-1


Modulación de la actividad mastocitaria

HO-1


Activación de basófilos

HO-1


Quimiotaxis de neutrófilos

HO-1


Adhesión leucocitaria

HO-1


Cascada del complemento

HO-1


Asma

MDA, F2-IsoPs, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, Cl-Tyr, Proteínas carboniladas, HO-1 (AFB), NF-κB, NO

Matera, 1998; Baldwin, 2001; Dalle-Donne et al., 2006.

Daño pulmonar

NO2-Tyr, F2-IsoPs, GST

Dalle-Donne et al., 2006: Fletcher et al., 2015.

Sistema Respiratorio



Mañon Rossi et al.



Enfermedad


Referencia

Displasia broncopulmonar

NO2-Tyr (severa en neonatos), Proteínas carboniladas


Enfermedad pulmonar intersticial F2-IsoPs


Enfermedad pulmonar obstructiva

HNE, F2-IsoPs, NO2-Tyr, Proteínas carboniladas, HO-1


Fibrosis carbonila idiopática

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, Proteínas carboniladas


Hipertensión pulmonar

F2-IsoPs


Síndrome de distrés respiratorio agudo

F2-IsoPs, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, Cl-Tyr, Di-Tyr, Proteínas carboniladas


Síndrome de distrés respiratorio

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG Dalle-Donne et al., 2006.

Hiperoxia

HO-1


Hipoxia

HO-1


Rinitis alérgica

HO-1


Asbestosis

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG Dalle-Donne et al., 2006.

Sistema renal Enfermedad renal crónica

F2-IsoPs, Di-Tyr, Proteínas carboniladas


Insuficiencia renal crónica

Cl-Tyr, Proteínas carboniladas


Daño agudo renal

HO-1 COX-2

Turini y DuBois, 2002; Sánchez et al., 2005:

Isquemia-reperfusión renal

HO-1, glicol timidina

Sánchez et al., 2005; Lowe, 2014.

Glomerulonefritis

HO-1


Uremia



Uremia asociada con hemodiálisis proteínas S-glutationadas peritoneal


Erección del pene

HO-1


Aceruloplasminemia



Esferocitosis

Proteínas S-glutationadas


Siclemia

F2-IsoPs, NF-κB

Baldwin, 2001; DalleDonne et al., 2006.

Ataxias

Proteínas S-glutationadas, incremento en H2O2 y radical superóxido, detección de F2-IsoPs, 8-OHdG y MDA, disminución de GSH libre y aumento de GSH unido a hemoglobina (de Friedreich), decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG (telangiectasia)

Dalle-Donne et al., 2006; Santos et al., 2010; Gomes y Santos, 2013.

Autismo

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, GPx

Frustaci et al., 2012; Rose et al., 2012.

Sistema nervioso



Mañon Rossi et al.



Enfermedad


Referencia

Daño a la médula espinal

F2-IsoPs, HO-1


Desorden bipolar y depresión

Peroxidación lipídica, NO, HNE, MDA, 8-OHdG, incrementa la concentración de CAT, GPx

Brown et al., 2014; de Sousa et al., 2014; Moylan et al., 2014.

Deterioro Cognitivo Leve (MCI)

HNE, acroleina


Enfermedad de Alzheimer

MDA, HNE, F2-IsoPs, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, Proteínas carboniladas, HO-1, COX-2

Sengupta, 1999; Turini y DuBois, 2002; Sánchez et al., 2005; Dalle-Donne et al., 2006; Shichiri, 2014.

Enfermedad de Creutzfeldt–Jakob F2-IsoPs


Enfermedad de Huntington

F2-IsoPs, aumento de la actividad de NADPH oxidasa

Dalle-Donne et al., 2006; Valencia et al., 2013.

Enfermedad de Parkinson

HNE, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, Proteínas carboniladas, F2-IsoPs, neuroprostanos, 8-OHdG

Dalle-Donne et al., 2006; Seet et al., 2010; Shichiri, 2014.

Esquizofrenia

SOD, GPx, CAT, MDA, GSH, HNE, NO, proteínas carboniladas,

Flatow et al., 2013, Möller et al., 2015.

Isquemia cerebral

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO

Bashkatova y Rayevsky, 1998; Dalle-Donne et al., 2006.

Síndrome de Down

F2-IsoPs, disminución del contenido de CoQ10 en linfocitos y plaquetas

Dalle-Donne et al., 2006, Tiano y Busciglio, 2011; Tiano et al., 2012; Shichiri, 2014.

Ictus

NF-κB, COX-2

Baldwin, 2001; Turini y DuBois, 2002

Cáncer

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr (pulmón). Proteínas carboniladas (pulmón), proteínas S-glutationadas (carcinoma de células renales), HO-1, NF-κB, NO, COX-2. MDA, hidroperóxidos de lípidos totales y proteínas carboniladas (leucemia mieloide crónica), 8-OHdG

Maeda y Akaike, 1998; Sengupta, 1999; Baldwin, 2001; Turini y DuBois, 2002; Chun y Surh, 2004; Sánchez et al., 2005; DalleDonne et al., 2006; Ahmad et al., 2008; Singh et al., 2009; Lowe, 2014.

Diabetes (tipos 1 y 2)

MDA, F2-IsoPs, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, proteínas S-glutationadas, NO2Tyr, Proteínas carboniladas, NF-κB, COX-2, NADPH oxidasa; HO-1

Baldwin, 2001; Turini y DuBois, 2002; Dalle-Donne et al., 2006; Kilgour y Roberts, 2014; PérezGallardo et al., 2014; Fredenburgh et al., 2015; Marco et al., 2015.

Preeclampsia

MDA, Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, NO2-Tyr, proteínas carboniladas, HO-1


Endometriosis

GSH, lipoperoxidación, HO-1, iNOS, 8-OHdG, proteínas carboniladas

Carvalho et al., 2013; Santulli et al., 2014.

Hiperhomocisteinemia

F2-IsoPs


Otras



Mañon Rossi et al.



Enfermedad


Referencia

Hiperosmolaridad córnea

HNE, MDA, aconitasa-2, 8-OHdG, HO-1, COX-2; SOD, GPx

Deng et al., 2015.

Cataratas (génesis)

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, proteínas S-glutationadas, Proteínas carboniladas


Retinopatía

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG Turini y DuBois, 2002; Dalle-Donne et al., 2006; (de prematuridad), COX-2, TBARS, NO y GSH Sharma et al., 2015. (diabética)

Sarcoidosis



Progeria



Síndrome Werner

Decrece la concentración GSH y(o) relación GSH:GSSG, Proteínas carboniladas


Amiloidosis sistémica



Obesidad

F2-IsoPs, 8-OHdG, 8-hidroxiguanosina

Dalle-Donne et al., 2006; Ramachandra et al., 2015.

Caquexia

NF-κB

Baldwin, 2001

Síndrome Zellweger

F2-IsoPs


Trasplantes de órganos y tejidos

HO-1, COX-2, glicol timidina

Turini y DuBois, 2002; Sánchez et al., 2005; Lowe, 2014.

Anemia de Falconi

Aumenta la relación GSH:GSSG y el balance prooxidante-antioxidante, disminuyen las actividades de CAT y SOD

Pagano et al., 2013.

Talasemia

8-OHdG, hidroperóxidos lipídicos

Ferro et al., 2012

Distrofia muscular

Aumenta la concentración de proteínas carboniladas y la oxidación de proteínas tiólicas

Iwasaki et al., 2013; Terril et al., 2013

8-OHdG: 8-hidroxy-2′-deoxiguanosina;

GPx: Glutatión peroxidasa;

iNOS: Óxido nítrico sintasa inducible;

CAT: catalasa;

GR: Glutatión reductasa;

MDA: Malonil-dialdehído; NF-κB: Factor de transcripción nuclear κB;

Cl-Tyr: 3-Clorotirosina;

GSH: Glutatión reducido;

CoQ10: Co-enzima Q10;

GSSG: Glutatión oxidado;

NO: Óxido nítrico;

COX-2: Ciclo-oxigenasa;

GST: Glutatión-S-transferasa;

NO2-Tyr: 3-Nitrotirosina;

Di-Tyr: o,o’-Ditirosina;

HNE: 4-hidroxi-2-nonenal;

F2-IsoPs: F2 isoprostanos;

HO-1: Hemo-oxigenasa 1;

TBARS: Especies tiobarbitúrico

Uso de sondas para detectar el daño por estrés oxidativo mediante exomarcadores La capacidad de medir in vivo las concentraciones de pequeñas moléculas dañinas y de señalización, tales como ERO, es esencial para la comprensión de sus funciones biológicas. Mientras que una http://jppres.com/jppres

reactivas

del

ácido

variedad de métodos se puede aplicar a sistemas in vitro, es un reto aun la medición in vivo de las concentraciones y los cambios relativos en las especies reactivas (Logan et al., 2014). Un enfoque hacia la consecución de este objetivo es el uso de biomarcadores. Por ejemplo, compuestos exógenos se administran por sonda al organismo intacto y J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 77

Mañon Rossi et al.

luego son transformados por las moléculas reactivas para producir un biomarcador de diagnóstico. El exomarcador y la sonda precursora pueden analizarse ex vivo por espectrometría de masas para inferir la identidad y las cantidades de las especies reactivas presentes in vivo. Esto es similar a la medición de los biomarcadores producidos por la interacción de especies reactivas con biomoléculas endógenas. Recientemente, se han desarrollado compuestos, como MitoB (un fragmento lipofílico catiónico de trifenilfosfonio unido a un ácido arilborónico), para deducir las concentraciones de peróxido de hidrógeno mitocondrial dentro de moscas (Cochemé et al., 2011; 2012) y ratones (Porteous et al., 2010). Nanomateriales dirigidos por ERO utilizados como teranósticos Se ha reportado que para el uso diagnóstico de los nanomateriales, un agente ideal sería el que genere señales por imágenes en respuesta al exceso de ERO. Esto podría hacerse con varias modalidades de imagen, como la imagen óptica, la resonancia magnética y la tomografía por emisión de positrones. Estos agentes de imagen pueden ser sensibles a receptores, dependientes del flujo sanguíneo o sensibles a reacciones con otros elementos. Los retos, sin embargo, incluyen su capacidad para dirigirse a moléculas que son razonablemente estables. La permeabilidad es también un aspecto importante de los agentes de formación de imágenes. En particular, para un agente de dirección neuronal, atravesar la barrera hematoencefálica puede ser un factor limitante. La eficacia in vivo, por lo tanto, también dependería de la permeabilidad, así como la supervivencia en plasma y la perfusión de los órganos (Kim et al., 2015). Por tanto, un nanomaterial biológico dirigido idealmente tendría que combinar la especificidad de destino (al blanco) y la sensibilidad de estímulos que, en conjunto, mejoraría la eficacia como agente teranóstico. El nanomaterial dirigido por ERO para objetivos teranósticos es muy probable que sea un agente multifuncional que sea sensible a los cambios redox locales específicos (Zielonka et al., 2012). Sin embargo, cualquier nanomaterial utilizado para estos fines tendrá que someterse a estudios preclínicos rigurosos en animales y en http://jppres.com/jppres


humanos antes de que puedan ser utilizados en un entorno clínico más amplio. Consideraciones finales Un diseño adecuado de un protocolo de ensayo clínico con un producto antioxidante debe considerar una selección de los biomarcadores del estrés oxidativo, según el esquema terapéutico sea profiláctico o terapéutico, así como las características individuales de los pacientes incluidos en el estudio. Los ensayos clínicos de antioxidantes han tratado de medir la eficacia en función de los puntos finales de la observación clínica. Sin embargo, muy pocos ensayos han monitoreado los biomarcadores de la oxidación. Los ensayos clínicos futuros con antioxidantes deben monitorear los biomarcadores del estrés oxidativo en pacientes con niveles altos documentados del estrés oxidativo. Estos biomarcadores deben ser monitoreados para mostrar el efecto directo del antioxidante objeto del estudio clínico sobre el estado redox del paciente (Shishehbor y Hazen, 2004; Shah et al., 2014). CONCLUSIONES La identificación y el desarrollo de biomarcadores específicos de estrés oxidativo son importantes, ya que este proceso es crucial para varias enfermedades humanas, como las cardiovasculares, neurodegenerativas, tumorales, virales, inmunológicas, metabólicas y respiratorias, entre otras. Por lo tanto, encontrar biomarcadores que ayuden con el diagnóstico precoz podría tener efectos beneficiosos para el desarrollo de fármacos y otras investigaciones terapéuticas. Del mismo modo, los biomarcadores que muestran reversibilidad de los efectos nocivos en respuesta al tratamiento podrían ayudar a detectar con prontitud el éxito o fracaso de éste. CONFLICTO DE INTERÉS Los autores declaran no poseer conflictos de interés. AGRADECIMIENTOS Los autores agradecen el financiamiento de los Proyectos FONDOCYT 2012-2013-2A1-58 (República Dominicana) y FONDECYT 1130601 (Chile). J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 78

Mañon Rossi et al.


REFERENCIAS

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Selective cytotoxic effect of 1-O-undecylglycerol in human melanoma cells [Efecto citotóxico selectivo del 1-O-undecilglicerol en células de melanoma humano] 1

1

2

Marian Hernández-Colina *, Alberto Martín Cermeño , Alexis Díaz García 1

Instituto de Farmacia y Alimentos, Universidad de la Habana, Calle 222, No. 2317, entre 23 y 31, La Coronela, La Lisa, CP 13600, La Habana, Cuba. 2 Laboratorios de Producciones Biofarmacéuticas y Químicas (LABIOFAM). Ave. Boyeros Km 16½, Rpto. Mulgoba, Boyeros, La Habana, Cuba. *E-mail: [email protected]

Abstract

Resumen

Context: 1-O-alkylglycerols are ether-linked glycerols derived from shark liver oil and found in small amounts in human milk. Previous studies showed antineoplastic activity for this family of compounds, structurally related to alkylphospholipids, but the activity of linear chain synthetic alkylglycerols in cancer cell lines is less documented. Melanoma is a high incidence cancer, highly resistant to potential treatments. Finding new anti-cancer compounds to improve melanoma prognosis is a relevant research issue.

Contexto: Los 1-O-alquilgliceroles son éteres presentes en el aceite de hígado de tiburón y en la leche materna. Han mostrado actividad antineoplásica, pero está poco documentada para alquilgliceroles sintéticos de cadena lineal. La búsqueda de nuevos antitumorales para mejorar el pronóstico del melanoma resulta relevante, debido a su alta incidencia y resistencia.

Aims: To study the cytotoxic effect of 1-O-undecylglycerol in primary cultured normal fibroblasts and A375 human melanoma cell line. Methods: Cells were treated with different concentrations of 1-Oundecylglycerol and viability assessed by MTT assay. Morphological changes were visualized by DAPI and acridine orange-ethidium bromide staining. Mitochondrial membrane potential was evaluated, and gene expression of P53 and BcL-2 was semi-quantified. Results: 1-O-undecylglycerol decreased viability of A375 cells and exerted very low cytotoxicity on primary cultured normal fibroblasts. Necrosis appeared in A375 cells but not in fibroblasts, and no apoptotic changes were visualized in DAPI staining experiments. After 24 h fibroblasts and melanoma cells developed mitochondrial potential changes similar to valinomycin. The gene expression of P53 and BcL-2 decreased in treated cells. Conclusions: 1-O-undecylglycerol exhibited selective cytotoxic activity in A375 melanoma cells when compared with primary cultured fibroblast. Its toxicity is mediated by necrosis that may be related with mitochondrial events and decrease in P53 and BcL-2 expression. The results suggest that UDG could be a useful strategy to combine with other chemotherapeutic agents in melanoma treatment. Keywords: Alkylglycerols, cytotoxicity, melanoma, primary cultured fibroblasts.

Objetivos: Estudiar el efecto citotóxico del 1-O-undecilglicerol en cultivo primario de fibroblastos normales y la línea celular A375 de melanoma humano. Métodos: En células tratadas con diferentes concentraciones de 1-Oundecilglicerol se monitoreó la viabilidad mediante ensayo con MTT. Los cambios morfológicos se visualizaron por tinción con DAPI y naranja acridina- bromuro de etidio. Se evaluó el potencial de membrana mitocondrial, y se semi-cuantificó la expresión de los genes P53 y BcL-2. Resultados: El 1-O-undecilglicerol redujo la viabilidad de las células A375, y ejerció poca citotoxicidad en el cultivo primario de fibroblastos normales. Ocurrió necrosis en las células A375 pero no en los fibroblastos, y no se visualizaron cambios apoptóticos en la tinción con DAPI. Luego de 24h ambas células desarrollaron cambios en el potencial de membrana mitocondrial similar a la valinomicina, y disminuyó la expresión de los genes p53 y BcL-2. Conclusiones: El 1-O-undecilglicerol mostró actividad citotóxica selectiva en células A375 al compararlo con cultivo primario de fibroblastos humanos. Su toxicidad es mediada por necrosis, probablemente por eventos mitocondriales y disminución en la expresión de P53 y BcL-2. Ello sugiere que el 1-O-undecilglicerol pudiera ser útil en combinación con otros quimioterapéuticos en el tratamiento del melanoma. Palabras Clave: Alquilgliceroles, citotoxicidad, cultivo primario de fibroblastos melanoma, necrosis.

ARTICLE INFO Received | Recibido: February 5, 2016. Received in revised form | Recibido en forma corregida: April 5, 2016. Accepted | Aceptado: April 5, 2016. Available Online | Publicado en Línea: April 9, 2016. Declaration of interests | Declaración de Intereses: The authors declare no conflict of interest. Funding | Financiación: The authors confirm that the project has not funding or grants. Academic Editor | Editor Académico: Gabino Garrido.

_____________________________________

Hernández et al.

INTRODUCTION Shark liver oil (SLO) is successfully used as therapy for several diseases, i.e. cancer, inflammation (Iannitti and Palmieri, 2010). Obtained from sharks that live in deep cold waters, it contains alkylglycerols (AKG) and squalene as major components, among other lipids as unsaturated fatty acids (Bordier et al., 1996, Qian et al., 2014). SLO exhibited antineoplastic activity in Walker 256 tumorbearing rats (Iagher et al., 2013), and in human mammary, ovarian carcinoma and prostate cancer cell lines (Krotkiewski et al., 2003). This activity is related to AKG content, and SLO with low content of AKG showed no activity in transformed cells (Davidson et al., 2007). AKG are alkyl ethers of glycerol that represent about 20% of SLO (Hallgren and Larson, 1962), usually as follows: 12:0 (1-O-dodecylglycerol), 1-2%; 14:0 (1O-tetradecylglycerol), 1-3%; 16:0 (1-Ohexadecylglycerol, chimyl alcohol), 9-13%; 16:1 n-7 (1-O-hexadec-7-enylglycerol), 11-13%; 18:0 (1-Ooctadecylglycerol, batyl alcohol), 1-5%; 18:1 n-9 (1O-octadec-9-enylglycerol, selachyl alcohol), 5468%; 18:1 n-7 (1-O-octadec-7-enylglycerol), 4-6%, and other (< 1%). This family of compounds acts as biological response modifiers. As anti-tumor agents, they have been related to inhibitory growth, antimetastatic activity, anti-neoangiogenic action, and induce differentiation and apoptosis in cancer cells (Deniau et al., 2011, Molina et al., 2013). Immune stimulation properties (Kantah et al., 2012; Qian et al., 2014) and brain drug delivery enhancing (Hülper et al., 2013) have also been attributed to these substances. The antineoplastic actions of linear chain synthetic AKG in cancer cell lines is less documented, but Sotomayor demonstrated cytotoxic activity in MCF-7 breast cancer cells (Sotomayor et al., 2006). Non-selective cytotoxicity and drug resistance are recurrent issues in most of available cancer chemotherapy. In this context, natural products, derived from plants or animals, have drawn attentions of many scientists (Block et al., 2015). Melanoma is a malignant skin tumor induced by transformation of melanocytes, whose incidence rate is rapidly increasing in the world. Metastatic melanoma has a very poor prognosis, a fact that is http://jppres.com/jppres

Cytotoxicity of 1-O-undecylglycerol in melanoma

in part due to its high resistance to cytotoxic agents (Cattaneo et al., 2015). Hence, finding new anticancer compounds, to improve melanoma prognosis is a relevant research issue. In melanoma, immune regulation at the level of the tumor microenvironment is a key factor in treatment (Galon et al., 2012), so immunomodulating agents as AKG could be a right choice. The combination of immunomodulatory action and antineoplastic potential could be a good strategy in melanoma treatment. It becomes relevant to study the cell death mechanisms associated with AKG cytotoxicity in melanoma cells. In this context, the aim of the present study is to evaluate the cytotoxic properties of synthetic 1O-undecylglycerol (UDG) in primary cultured normal fibroblasts and A375 human melanoma cells. It was further studied the cell death induced by UDG, its relationship with gene expression of death associated proteins, and changes in mitochondrial potential. MATERIAL AND METHODS Compound and reagents All reagents were obtained from Sigma–Aldrich Corp. (St. Louis, MO, USA), unless otherwise stated. 1-O-undecylglycerol was synthesized in Food and Pharmacy Institute, with 95% of purity, by Williamson´s synthesis, as previously reported (León et al., 2002). A stock solution of UDG was prepared in absolute ethanol at 50 mM. In every experiment, it was diluted in complete culture media to 150 µM as work solution. Primary culture of human fibroblasts (FF) and A375 human melanoma cells Human fibroblasts were aseptically collected from a biopsy of a healthy donor of plastic surgery. It was consented and approved for ethical committee of Pediatric Hospital Juan Manuel Márquez, La Habana, Cuba. Donor sample was negative for HIV, hepatitis, and other possible infectious diseases. The culture was obtained as described previously (González et al., 2009). The trypsin/EDTA medium was replaced with fresh medium three times, and fiJ Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 85

Hernández et al.

broblast were cultured in Dulbecco’s Modified Eagle’s medium (DMEM) with 10% fetal bovine serum, 100 U/mL penicillin and 100 μg/mL streptomycin, in T-25 cm2 tissue culture flask (Corning Costar Co., Lowell, MA, USA), and maintained in an incubator with a humid atmosphere at 37°C under 5% CO2. A375 cells were obtained from the American Type Culture Collection (ATCC CRL-1619). The cell line was cultured in RPMI-1640 (Hyclone, UT, USA), supplemented with 10% fetal bovine serum (Gibco, Life Technologies, USA) and 50 µg/mL gentamycin, in T-25 cm2 tissue culture flasks. Cells were passaged twice a week at the ratio of 1:5 to keep an exponentially growing state. Cell viability assay The viabilities of A375 cells or primary cultured fibroblasts were evaluated using the [3-(4,5-dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyl tetrazolium bromide] (MTT) colorimetric assay (Mossman, 1983). Both types of cells (6 x 103) were incubated for 24 or 48 h in 96-well microtiter cell culture plates, in the absence (control cells) or presence of UDG, in a 200 µL final volume. After the treatments, cells were incubated for 4 h at 37⁰C with 20 µL of MTT 5 mg/mL. The blue MTT formazan precipitate was dissolved in 50 µL of isopropyl alcohol, and after 30 minutes of agitation at 37⁰C, the absorbance was measured at 570 nm on a multiwell plate reader SUMA PR-521 (TecnoSuma, Cuba). Cell viability is expressed as a percentage of these values in treated cells, compared to the non-treated (control) cells. Morphological changes visualization by DAPI and acridine orange-ethidium bromide (AO/EtBr) staining For visualization of morphological changes, A375 or FF cells (4 x 104) were cultured in 24 wells plate, and treated with low concentrations of UDG for 24 or 48 h, or untreated. FF cells were treated with 18.75 µM UDG, correspondent to 1/8 of maximum concentration assayed. A375 cells were treated with 5 µM UDG, which represents 1/16 of concentration that inhibits 50% control viability after the incubation period (IC50). Fixation solution was added, 500 µL of acetic acid/methanol (1:2) for 2 min, and then plates were washed twice. 6http://jppres.com/jppres


diamidino-2-phenylindole (DAPI) staining (1 mg/mL) was added for 20 minutes, at 20⁰C in the dark. For AO/EtBr assay, cells were stained with a 1:1 mix of 100 µg/mL acridine orange and ethidium bromide in 1x PBS solution for 5 minutes. In both cases, cells were then observed under a fluorescence microscope (Olympus IX71, camera Olympus DP72, Japan) at 10x magnification. Mitochondrial membrane potential The mitochondrial membrane potential was visualized using Mitochondria Staining Kit (for mitochondrial potential changes detection; Sigma, St. Louis, MO, USA), which includes JC-1 dye. The JC-1 probe is a cationic dye that exhibits membrane potential-dependent accumulation in mitochondria, as indicated by a fluorescence emission shift from green to red. Mitochondrial depolarization is specifically indicated by a decrease in the red-to-green fluorescence intensity ratio (Cossarizza et al., 1993). The cells were incubated for 1, 12 or 24 h in the absence (control) or presence of UDG (18.75 µM in FF cells, and 5.25 µM for A375 cells) or valinomycin 1 µg/mL. After the JC-1 dying, fresh media was added, and observed under a fluorescence microscope (Olympus IX-71, Japan), with 480 nm and 520 nm filters. Fields were photographed with an Olympus DP-72 camera (Olympus, Japan). Reverse transcription polymerase chain reaction (RT-PCR) Total cellular RNA was extracted from treated and control cells, A375 and FF, at 24 and 48 h after treatment, using 1 mL Trizol reagent (Invitrogen, USA) according to the manufacturer’s instruction. The extracted RNA was dissolved in RNase-free water. The RNA concentration was determined using spectrophotometer (Bio Photometer plus, Eppendorf). Equivalent volume for 2 µg of RNA was reverse transcribed using 2 µL of reverse transcriptase (RT). RT was carried out for 60 min at 42⁰C in a thermocycler (Nashita 4196, Spain). PCR was performed in a total reaction volume of 25 µL that contained 5 µL of cDNA solution and 1.25 μL of sense and antisense primers. The primers for GAPDH, p53 and Bcl-2 in forward and reverse were as follows: GAPDH (200 bp): 5’J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 86

Hernández et al.

CCTTCCTGGGCATGGAGTCCTG-3’ and 5’GGAGCAATGAGCTTGATCTC-3’; p53 (100 bp): 5’GGGTTAGTTTACAATCAGCCACATT-3’ and 5’GGCCTTGAAGTTAGAGAAAATTCA-3’; Bcl-2 (100 bp): 5’-CAGGTCCTCTCAGAGGCAGATAC-3’ and 5’-CCTCTCCAGGGACCTTAACG-3’. PCR was performed using the following procedure: 59⁰C for 1 min followed 35 cycles of 94⁰C for 1.5 min and 72⁰C for 1 min, and completed with one cycle at 72⁰C for 7 min. For visualization, PCR products were analyzed on a 2% agarose gel. The gel images and relative intensity of each band were obtained using Quantity one software (Bio-Rad, USA), after normalized to the corresponding GAPDH band. Statistical analysis The software program GraphPad Prism 5.0 (GraphPad Software Inc., USA) was used for statistical analysis. The data are expressed as mean ± standard error of mean (SEM). Comparisons between the different groups were performed by the one-way analysis of variance (ANOVA) followed by the Newman–Keuls multiple comparison test. Differences at p < 0.05 were considered statistically significant. The IC50 values for cell viability were estimated using a non-linear regression algorithm. RESULTS Cell viability assay Incubation of A375 cells with UDG (Fig. 1A-B) promoted significant decrease in cell viability in concentration and time-dependent manner, as estimated by the MTT assay. The assessed IC50 value was 94.59 µM for 24 h and 82.06 µM for 48h. FF cells viability was slightly affected by UDG treatment for 24 h in a concentration-dependent manner. The IC50 for these cells was not reached for assayed concentrations. At 48 h (Fig. 1B), FF cells keep their viability, and A375 cells are more affected by UDG from 75 µM. Accordingly, these results reveal that UDG exhibited more selectively activity against melanoma cells, with low cytotoxicity to normal fibroblasts.



Morphological changes of FF and A375 cells by AO/EtBr and DAPI staining Cells were stained with AO/EtBr to visualize cell death after 24 and 48 h of treatment. Morphological changes in A375 and FF cells were observed under the fluorescence microscope after exposure to UDG and shown in Fig. 2. After 24 h both cell lines were affected by UDG, and almost all cells exhibited orange-red fluorescence, indicating increased membrane disruption; and looked intact, with nuclear morphology resembling that of viable cells, which appears to be a necrotic event. At 48 h A375 cells showed clear growth inhibition, with an orange nucleus, determining necrotic events. FF cells exhibited yellow nucleus, as a signal of recovery of their viability. The absence of DNA fragmentation was confirmed by DAPI staining. Neither A375 nor FF cells showed apoptotic characteristics when stained with DAPI. Changes in mitochondrial membrane potential To explore the effects of UDG on the mitochondrial membrane potential, FF and A375 cells were cultured with UDG or valinomycin for 1, 12 and 24 h, and then processed for confocal microscopy analysis after being stained with fluorescent probe JC-1. The dye enters selectively into the mitochondria and reversibly changes its color from red to green as the membrane potential decreases (Cossarizza et al., 1993). After treatment with UDG, the cells showed increased green fluorescence similar to valinomycin as a positive control, in a timedependent manner (Fig. 3). It suggests that UDG disrupts the mitochondrial membrane potential, resulting in the cytosolic accumulation of monomeric JC-1. p53 and BcL-2 gene expression using RT-PCR The expression levels of p53 and BcL-2 genes in FF and A375 cells were evaluated to explore the possible mechanism of UDG induced necrotic cell death by RT-PCR and agarose gels band semiquantitation. In both cells p53 gene expression decreased in a time-dependent manner, and also, BcL-2 exhibited a similar pattern (Fig. 4). J Pharm Pharmacogn Res (2016) 4(2): 87

Hernández et al.


A

B

Figure 1. Effects of 1-O-undecylglycerol (UDG) on A375 cells and normal fibroblasts (FF) viabilities, estimated by the MTT assay. Panels (A) and (B) display the effects at 24 and 48 h, respectively. The bars are mean ± SEM of three experiments. Different letters in the same series symbolize significant differences (p < 0.05) by ANOVA and post hoc Newman Keuls tests.



Hernández et al.


Control

UDG 24 h

UDG 48 h

A

FF

B

C

A375

D

Figure 2. Effects of 1-O-undecylglycerol (UDG) on morphological changes in fibroblasts (FF) and A375 cells, detected by AO/EB double fluorescence (green-orange) and DAPI staining (blue). FF and A375 cells were incubated with UDG 18.75 µM and 5 µM, respectively for 24 or 48 h. (A) FF cells stained with AO/EB and (B) with DAPI. (C) A375 cells stained with AO/EB and (D) with DAPI. Cells were observed using fluorescence microscopy (160X) after staining.



Hernández et al.


Control

1h

12 h

24 h

Valinomycin

FF

UDG

Valinomycin

A375

UDG

Figure 3. Effects of 1-O-undecylglycerol (UDG) and valinomycin on mitochondrial membrane potential changes in fibroblasts (FF) and A375 cells, detected by JC-1 staining. FF and A375 cells were incubated with UDG 18.75 µM and 5 µM, respectively, or valinomycin 1 µg/mL for 1, 12 and 24 h. Cells were observed using fluorescence microscopy (160X) after staining.



Hernández et al.


A

C

24 h

48 h

p53

bcl-2

gapdh

B

C

24 h

48 h

p53

bcl-2

gapdh

Figure 4. Semi-quantitative RT-PCR analysis of p53 and BcL-2 gene expression in fibroblasts (A) and A375 (B) cells, control (C) and treated with 1-O-undecylglycerol (UDG) for 24 or 48 h, with GAPDH as housekeeping gene. FF and A375 cells were incubated with UDG 18.75 µM and 5 µM, respectively. The bars are mean ± SEM of three experiments. *p