Laser scanning microscopy as a versatile platform

0 downloads 0 Views 2MB Size Report
very high frequency current on fast photo-detectors[12]. ..... depletion layer, t2; (3) carrier transit time in the depletion layer, t3=d2/μVR, ..... M. J. Booth & T. Wilson, "Low-cost, frequency-domain, fluorescence lifetime confocal microscopy", J. of.

Laser Scanning Microscopy as a Versatile Platform: Imaging based  on Nonlinear and Ultrafast Effects   

Fu-Jen Kao*  Institute of Biophotonics Engineering, National Yang Ming University, Taipei 112, Taiwan  Institute of Electro-Optical Engineering, National Sun Yat-sen University, Kaohsiung 80424,  Taiwan   

ABSTRACT    The nature of scanning image acquisition greatly facilitates incorporation of various contrast signals for imaging and  integration with techniques in signal processing. In this study,  we are reporting imaging modalities and techniques  based  on  nonlinear  optical  and  ultrafast  effects  that  are  excited  by  ultrafast  laser.  Additionally,  the  use  of  signal  processing  electronics  allows  signal  conditioning  techniques,  such  as  dithering,  lock-in  detection,Ö etc,  to  be  employed so that better signal to noise ratio can be resulted and special features in imaging can be emphasized.  Keywords: Optical parametric oscillator, second harmonic generation, third harmonic generation, radio frequency,  optical beam induced current, dithering, laser scanning microscopy   

1. INTRODUCTION    Scanning optical  microscopy  has become a versatile and powerful tool in  many disciplines. The optical sectioning  capability  is  increasingly  applied  in  the  study  of  three-dimensional  structures  commonly  encountered  in  biology,  medicine  and  material  sciences.  The  employment  of  ultrafast  lasers  as  the  excitation  light  sources  has  enabled  imaging  contrasts  based  on  multi-photon  excitations,  such  as  2-p  fluorescence,  second-  and  third  harmonic  generation, coherent anti-Stoke Raman scattering[1]. In this study, the output from a sync-pumped OPO at 1240 nm  is  used  to  demonstrate  imaging  that  is  based  on  second-  and  third  harmonic  generation.  It  is  well  known  that  all  materials  possess  non-vanishing  third-order  susceptibilities.  However,  if  the  medium  at  the  focal  point  of  the  scanning  laser  beam  is  homogeneous,  the  third  harmonic  generated  before  and  after  the  focal  point  interferes  destructively  and  results  in  no  net  signal.  Non-vanishing  THG  will  result  if  there  is  inhomogenieties  at  the  focal  point[2].  This  characteristic  makes  THG  an  ideal  probe  for  interfaces  and  boundaries.  On  the  other  hand,  intense  SHG has long been observed on biological samples with the so-called bio-photonic structures[3]. We are presenting  here a case study of dental sections with laser scanning THG and SHG microscopy[4-10]. Teeth are the hardest and  most indestructible part in human body[11]. Their ordered structures and mineral-like properties make them an ideal  subject to demonstrate harmonic microscopy on.    Scanning image acquisition is effectively a sampling process, in which a high definition point spread function is used  to  sample  an  object  so  that  a  clear  2D,  3D,  or  even  multi-dimensional  image  can  be  reconstructed  from  the  accumulated data set. In this view, it is natural to employ techniques in signal processing to condition and to improve  the  signals  for  imaging.  For  instance,  the  very  short  temporal  width  of  ultrafast  laser  pulses  enables  generation  of  very high frequency current on fast photo-detectors[12]. Through these unique capabilities we introduces the novel  method  of  optical  beam  induced  current  (OBIC)[13-17]  that  is  used  to  map  the  frequency  transfer  properties  of  optically active electronic devices. This technique is based on and is hence termed radio frequency (RF) OBIC[12].  We have demonstrated this novel RF OBIC contrast on a PIN photodiode. These results were then compared to DC  OBIC  generation.  The  DC  response  of  the  particular  photodiode  revealed  a  uniform  spatial  profile,  whereas  the  spatial distribution of the response at RF excitation showed radial symmetry with center located at the wire-bonded  electrode. In addition, we are demonstrating the use of lock-in techniques in detecting differential signals[18-20].  * Tel: (02) 2820-4624, Fax: (02) 2823-5460, Email: [email protected] 

Information Optics and Photonics Technology, edited by Guoguang Mu, Francis T. S. Yu, Suganda Jutamulia, Proceedings of SPIE Vol. 5642 (SPIE, Bellingham, WA, 2005) · 0277-786X/05/$15 · doi: 10.1117/12.569454


2. HARMONICS AND UVB EQUIVALENT 2-P IMAGING    2.1 OPO and laser scanning microscope setup  In  harmonic  generation  imaging,  a  KTP  based  sync-pumped  OPO  (Mira-OPO,  Coherent)  is  used  to  generate  the  available  spectral  range  in  1.05~1.3  µm  for  harmonic  excitation  and  525~650  nm  (the  signal  waveís  frequency  double)  for  2-p  UV  fluorescence  excitation  as  shown  in  Fig.  1.  The  added  spectral  range  enables  multiphoton  processes  that  were  beyond  the  reach  of  a  Ti:sapphire  laser,  which  is  commonly  employed  in  2-p  confocal  microscopy. The pulse width is approximately 150 femtoseconds and the repetition rate is 76 MHz. Output power of  200 mW or less from the above laser system is sufficient for various nonlinear optical excitations. Sets of IR cut-off  and bandpass filters are used to discriminate SH and TH against background and other signals. THG and SHG are  collected in transmission mode to maximize signal strength due to their forward scattering nature. A set of objectives  with  NA  ranging  from  0.4  to  1.2  is  used  for  both  microscopy  and  micro-spectroscopy.  The  harmonic  signalsí  authenticity is verified by tuning the pumping wavelength and observing the corresponding spectral shift. SHG in the  dental  sections  is  produced  with  pulses  in  both  700-920nm  and  1050-1300nm  while  THG  is  only  observed  with  pulses in 1050-1300nm. No THG is found with 700-920nm excitation in the samples used. 

  Figure 1: Spectral distribution of commonly used lasers for scanning microscopy. Note the available spectral range of the syncpumped OPO and mode-locked Ti:sapphire laser. 

  A customized microscope setup capable of both transmission and reflection detection is shown in Fig. 2. Specialized  projection lenses are employed so that power loss in the chain of coupling optics can be minimized. A fiber coupling  based miniature spectrometer (USB2000, Ocean Optics) is also integrated into the system to facilitate spectroscopic  analysis.  2.2 Harmonic generation microscopy of dental sections  Human teeth consist of three primary components: enamel, dentin and pulp. The outer surface of a tooth is covered  by a thin and transparent layer of enamel that is made of calcium salts in the form of hydroxyapatite crystals. 


Proc. of SPIE Vol. 5642

  Figure 2: Multiphoton microscopy and micro-spectroscopy setup. 

  The microcrystals form enamel prisms or rods with 4-6 µm transverse dimensions. The interprismatic space is filled  with  proteins  that  form  an  organic  matrix[11].  The  microscopic  SHG  and  THG  images  near  the  dentinoenamel  junction  of  a  dental  section  are  shown  in  Fig.  3(a)  and  (b),  respectively.  Strong  SHG  and  THG  are  produced  in  dentin.  Microtubule  structures  there  can  be  clearly  seen  in  the  THG  image.  The  SHG  image,  however,  does  not  exhibit specific features and may simply reflect the distribution of collagen. For comparison, much weaker THG and  no  SHG  are  found  in  the  enamel,  which  forms  the  dark  part  in  the  upper-left  corner  of  the  image.  The  prismatic  structures  in  enamel  can  be  clearly  seen  in  the  THG  image  of  enamel,  shown  in  Fig.  3(c)  with  adjusted  contrast.  Enamel,  however,  does  generate  fluorescence  covering  from  450  nm  to  550  nm  under  2-photon  excitation  of  Ti:sapphire laser or single photon excitation from UV with wavelength less than 365 nm, as reported earlier[21,22].    Enamel




Dentin    (a)   








Figure 3: (a) SHG image acquired near the dentinoenamel junction (b) corresponding THG image (c) THG image of enamel. Note  that a much higher electronic gain was used since THG is a lot weaker in enamel than in dentin 


Proc. of SPIE Vol. 5642


The spectra of harmonics  from dentin and enamel are shown in Fig. 4 (a) and (b), respectively. Note that THG is  much stronger (~7X) in dentin than in enamel. SHG is only found in dentin. Strong SH has been found on various  biological specimens, such as collagen, potato starch, and skeletal muscles[3]. These materials all possess periodical  nano-structures  that  are  often  referred  as  (nonlinear)  bio-photonic  structures.  In  particular,  collagen  is  an  extracellular structural protein and is a major component of bone, cartilage, skin, and other tissues. Collagen fibrils have a  triple-helical structure and it has been shown that this structure enables collagen to generate SH from a wide range of  wavelengths in the infrared region. The SH responses from dentin and collagen are compared in Fig. 4(c) and 4(d).  The  sharp  rise  in  SH  signal  during  820-828  nm  for  dentin  and  796-806nm  for  collagen  indicates  the  existence  of  resonance effects, as shown in the inset of Fig. 4 (c) and (d). The 2-p auto-fluorescence, on the other hand, stays the  same both in spectral profile and signal strength. For incident wavelength longer than 830 nm, the SH signal greatly  surpasses that of 2-p auto-fluorescence and becomes the dominant signal. 























Figure 4: THG and SHG spectra measured at (a) dentin (b) enamel near the dentinoenamel junction. (c) SHG and 2-p fluorescence  from dentin (d) SHG and 2-p fluorescence from collagen (Type I). The corresponding excitation spectra of SHG are shown in the  inset in (c) and (d).   

  3. USE OF SIGNAL PROCESSING IN SCANNING IMAGING      3.1 Radio frequency optical beam induced current (RFOBIC)  In  addition  to  nonlinear  optical  excitation,  ultrafast  laser  pulses  will  generate  current  at  radio  frequencies  when  a  photo-diode is irradiated. The principle of OBIC is simple: a tightly focused pulsed laser light is shone on the surface  of a photosensitive semiconductor device. The relative position of the illumination and the specimen is changed in a  raster scanning  fashion. The  signal, corresponding to a given spatial location, is obtained via the electrical contact 


Proc. of SPIE Vol. 5642

and  a  bias  voltage  applied  on  the  device.  As  shown  in  the  power  spectra  in  Fig.  5,  the  spacing  between  adjacent  spectral peaks is equal to the pulse repetition rate (~76 MHz) of the laser. Overall, the RF spectra trail off at 3.0 GHz,  reflecting  the  diodeís  sub-nanosecond  response.  At  low  bias  voltage,  Fig.5(c)  4.0V,  the  high  frequency  response  (1.5GHz~3.0GHz)  of  the  photodiode  is  suppressed.  As  shown  in  Fig.  5(d)-(f),  the  high  frequency  response  is  substantially  improved  with  increasing  bias  voltage,  while  the  low  frequency  (0.  It  is  straightforward  to  carry  out  the  calculation  and  obtain 

I sig (t ) =


R0 i1

α2 +ω2

cos(ωt − φ ) ,   


ω φ = tan −1 ( )   is the phase shift and contains the information of response time. The response time,  τ α

, can 

then be easily derived by the following expression,   







tan(φ ) .   






Note that the response of the specimen is represented by R(t), with a single primary time constant so that the analysis  can be simplified. Experimentally the pertinent phase information,  φ , can be easily obtained by employing a duel  phase lock-in amplifier, in this case a SR830 made by Stanford Research. The duel channels within the lock-in allow  simultaneous  acquisition  of  the  detected  signal  at  two  different  phases,  i.e.  V ∝ R0i1 cos(θ + δ )   and  X

α2 +ω2

sin(θ + δ ) , where δ represents the total phase delay introduced by the optical and electronic system as a  α2 +ω2 whole.  In  this  way,  signals  from  the  two  channels  can  be  used  to  calculate  the  phase  and  thus  the  response  time  directly.  VY ∝


A high-speed 1550nm traveling-wave electroabsorption modulator (TWEAM) is used as the specimen and the photocurrent from it is used as the contrast signal. The photo-current is fed into the lock-in amplifier that used the signal  from the function generator as the reference. Two of the input channels in the confocal microscope (with a maximum  number of 5 channels) are used to take the duel outputs from the lock-in amplifier, VX and VY. In this way, mapping  at two different phases can be accomplished simultaneously. The two correlated images thus obtained can then be  used to calculate the corresponding response time according to Eqs. (2) and (3). As shown in Fig. 8, the contrast of  the photocurrent images is greatly improved with the employment of lock-in detection.   


Proc. of SPIE Vol. 5642










Figure 8: Improvement of scanning OBIC images with the use of lock-in detection. (a) A conventional OBIC image obtained from  the TWEAM device. Note the large background noise. (b) OBIC image obtained with modulation and lock-in detection. 

  4. CONCLUSIONS    In  conclusion,  scanning  optical  microscopy  presents  to  be a  versatile  platform  to  build  images  on  various  contrast  mechanisms. This unique capability has made it a powerful tool in numerous disciplines. Through the employment of  OPO, we have demonstrated the use of harmonic generation in imaging the enamel and dentin sections. These novel  imaging modes reveal unique contrast and do not suffer from photobleaching. The non-invasive nature also enables  live  sample  observation.  The  deep  penetration  depth  due  to  the  long  wavelength  used  allows  high  quality  and  optically  sectioned  SH  and  TH  image  acquisition  without  denaturing  sample  preparation  procedures,  such  as  polishing, decalcifying, and dye labeling. As expected, THG is sensitive to interfaces and boundaries while SHG is  attributed  to  collagen,  one  of  the  many  interesting  bio-photonic  structures.  In  addition,  we  have  found  that  the  intensity of SHG from collagen and dentin depends strongly on the incident wavelengths. Though the exact causes  are to be further identified.    The  RF  OBIC  method  is  expected  to  find  further  applications  in  non-contact  radio  frequency  injection,  near-field  radio frequency generation, and high-speed device characterization. In addition, the high peak power of the ultrafast  laser pulse also allows generation of photocurrent based on multi-photon excitation, which is the foundation of multiphoton  confocal  microscopy.  This  new  application  of  ultrafast  lasers  in  optical  microscopy  might  provide  insight  currently not available through conventional methods.[26]  Dithering is different from image processing, which is performed after image acquisition and does not increase the  dynamic  range  of  the  original  image.  Contrast  enhancement  through  dithering  and  lock-in  detection  is  particularly  evident at high spatial frequency due to the differential nature of the signal processing. However, the absolute spatial  resolution remains the same as a result such signal processing, i.e. cut-off frequency is not extended. It is expected  that the principles of dithering can be further applied to other scanning microscopy.      We have also shown that through modulation and lock-in detection, the S/N ratio of the acquired images is greatly  enhanced and the corresponding temporal response can be obtained from the phase information. This method permits  rapid measurement of single or primary lifetime components and presents an effective approach toward lifetime or  response time imaging. It is simple, robust and easy to be implemented when compared with many other methods.      The nature of scanning laser microscopy allows easy integration  with techniques in signal processing and presents  numerous  opportunities  worth  looking  into.  Many  tasks  remain,  however,  in  fully  developing  these  signals  and  techniques  into  reliable  and  useful  tools  for  basic  research  and/or  diagnosis.  For  instance,  much  more  work  is  required  to  fully  quantify  and  relate  the  conditions  of  samples  to  the  signals  so  obtained.  Nonetheless  these  developments have demonstrated to be new, noninvasive, and effective methods in probing a wide variety of subjects.        Proc. of SPIE Vol. 5642


ACKNOWLEDGMENTS  Support of this research by the National Science Council of Taiwan under grant No. NSC91-2112-M-110-009 and  NSC91-2736-L-110-001, and by the Ministry of Education of Taiwan under grant No. 89-B-FA08-1-4 is gratefully  acknowledged. 

REFERENCES    1.  A. Zumbusch, G.R. Holtom, S.X. Xie, "Vibrational microscopy using coherent anti-Stokes Raman scattering" ,  Phys. Rev. Lett. 82, pp4142-4145,1999.  2.  R. Boyd, Nonlinear Optics, Academic, New York, 1992.  3.  K. Clays, S. Van Elshocht, M. Chi, E. Lepoudre, A. Persoons, "Bacteriorhodopsin: a natural, efficient  (nonlinear) photonic crystal" , J. Opt. Soc. Am. B 18, pp1474-1482, 2001.  4.  P. J. Campagnola, M. Wei, A. Lewis, and L. M. Loew, " High-resolution nonlinear optical imaging of live cells  by second harmonic generation", Biophys. J. 77, pp3341-3349, 1999.  5.  L. Moreaux, O. Sandre, M. Blanchard-Desce, and J. Mertz, "Membrane imaging by simultaneous second  harmonic generation and two-photon microscopy" , Opt. Lett. 25, pp320-322, 2000.  6.  M. Kobayashi, K. Fujita, T. Kaneko, T. Takamatsu, O. Nakamura, S. Kawata, "Second-harmonic-generation  microscope with a microlens array scanner ",Opt. Lett. 27, pp1324-1326, 2002.  7.  J. A. Squier, M. M¸ ller, G. J. Brakenhoff and K. R. Wilson, " Third harmonic generation microscopy" , Opt. Exp.  3, pp315-324, 1998.  8.  D. Yelin and Y. Silberberg, " Laser scanning third-harmonic-generation microscopy in biology" , Opt. Exp. 5,  pp169-175, 1999.  9.  Y. Barad, H. Eisenberg, M. Horowitz and Y. Silberberg, " Nonlinear scanning laser microscopy by third  harmonic generation" , Appl. Phys. Lett. 70, pp24-26, 1997.  10.  S.-W. Chu, I-H. Chen, T.-M. Liu, P. C. Cheng, C.-K. Sun, and B.-L. Lin, "Multimodal nonlinear spectral  microscopy based on a femtosecond Cr:forsterite laser," Opt. Lett. 26, pp1909-1911, 2001.    11.  A. R. Ten Cate, Oral Histology 5th edition, Mosby, St. Louis, 1998.  12.  F.J. Kao, J.C. Chen, S.C. Shih, A. Wei, S.L. Huang, T.S. Horng, and P. Tˆ rˆ k, 2002, " Optical beam induced  current microscopy at DC and Radio Frequency ", Opt. Comm. 211, pp39-45, 2002.  13.  T. Wilson and C.J.R. Sheppard, Theory and Practice of Scanning Optical Microscopy, Academic Chap.9 (1984).  14.  B.P. Richards and P.K. Footner, The Role of Microscopy in Semiconductor Failure Analysis (Royal  Microscopical Society Microscopy Handbooks, 25), Springer Verlag, 1992.  15.  H. Komoda and K. Shimizu, " Optical Beam Induced Current Techniques for Failure Analysis of Very Large  Scale Integrated Circuits Devices" , Jpn. J. Appl. Phys. 33, pp3393-3401, 1994.  16.  C. Xu and W. Denk, " Two-photon optical beam induced current imaging through the backside of integrated  circuits" , Appl. Phys. Lett. 71, pp2578-2580, 1997.  17.  F.J. Kao, M.K. Huang, Y.S. Wang, S.L. Huang, M.K. Lee, and C.K. Sun, " Two-photon Optical Beam Induced  Current Imaging of InGaN Blue LEDs" , Opt. Lett. 24, pp1407-1409, 1999.  18.  M. Somekh, " Image formation in scanned heterodyne microscope systems" , J. Microscopy 160, 225, 1990.  19.  C.W. See and M. Vaez-Iravani, "Differential amplitude scanning optical microscope: theory and applications" ,  Appl. Opt. 27, pp2786-2792, 1988.  20.  J.C. Chen, F.J. Kao, and P. Tˆ rˆ k, Differential Intensity Contrast in Scanning Microscopy by Dithering, Focus  on Microscopy 2002, Kaohsiung, Taiwan.  21.  U. Hafstrˆ m-Bjˆ rkman, F. Sundstrˆ m and J. J. ten Bosch, ì Fluorescence in dissolved fractions of human  enamel,î  Acta Odontol Scand 49, pp133-138, 1991.  22.  D. Spitzer and J.J. Ten Bosch, " The total luminescence of bovine and human dental enamel" , Calcif. Tiss. Res.  20, pp201-208, 1976.  23.  E. O. Brigham, The Fast Fourier Transform, Prentice Hall Inc., Englewood Cliffs, New Jersey, Chap. 5, 1974.  24.  M. J. Booth & T. Wilson, "Low-cost, frequency-domain, fluorescence lifetime confocal microscopy", J. of  Microscopy, 214, pp. 36ñ42, 2004.  25.  J. R. Lakowicz, Principles of Fluorescence Spectroscopy, 2nd edn. Kluwer/Plenum, New York, Chap. 5, 1999.  26.  F.J. Kao, The Use of Optical Parametric Oscillator for Harmonic Generation and Two-photon UV Fluorescence  Microscopy, Microscopy Research and Techniques 63, p175-181, 2004. 


Proc. of SPIE Vol. 5642

Suggest Documents