8) Bowie A, Owens D, Collins P, Johonson A, and Tom- kin GH:Glycosylated low density ... 16) Haberland ME, Fogelman AM and Edward PA: Specificity of ...
117 動脈 硬 化
24(3):117-125,
1996
シ ンポ ジ ウムI
糖尿病と動脈硬化
糖 化 低 比 重 リポ 蛋 白(LDL)の
ヒ トマ ク ロ フ ァ ー ジ(Mφ)
に お け る異 化 機 構 に 関 す る検 討*
川
村
光
信1
宮
崎
滋1
寺
本
民
生2
木
下
誠2
胞 を 生 じ る こ と も知 られ て い る10).Modified
I. 糖 尿 病(DM)は
は じ め に
脈 硬 化 の 成 立 上Ox-LDLは,
動 脈 硬 化 の独 立 した 危 険 因 子 で あ る と
と考 え ら れ て い る2). ま た,
modified
み な され て い るが, その機 序 が どの よ うな もので あ るか は
度 がscavengerレ
充 分 に解 明 さ れ てい な い1).
わ れ て い る11,12)が, 一 方, LDLの
最近, 動 脈 硬 化 の発 生 ・進 展 に お い て, 酸 化low lipoprotein (Ox-LDL)の LDLは
density
役 割 が 重 要 視 され て い る2). Ox-
動 脈 硬 化 を促進 させ る さ ま ざ まな生 物 活 性 作 用, た
LDLの
うち動
in vivoで も っ と も重 要 で あ る
セ プ タ ー のligandの
LDLの
陰 性 荷 電 の程
能 力 を決 定 す る とい
遊 離 リジ ンの減 少 の程 度
の 方 が よ り重 要 で あ る と い う 見 解 も あ る13,14). Steinbrecher ら15)は,
aldehyde修
飾LDLがMφ
のscavengerレ
セ プ
タ ー で 認 識 さ れ ず, 異 化 量 は む し ろ 減 少 す る と報 告 し た.
とえ ば, 内皮 細 胞 へ の単 球 細 胞 の 粘 着, 単 球 の走 化性, マ
し か し, 彼 ら の デ ー タ か ら は,
クロ フ ァー ジのscavengerレ セ プ タ ー に よ る取 り込 み, 各
LDLを
種 成 長 因子 の調 節, サ イ トカ イ ン遺 伝 子 の発 現 な ど を, 有
で の 異 化 量 に 違 い が あ る と読 み 取 る こ と が で き る.
す る3).最 近 わ れ わ れ は, glucoseが ス ーパ ー オ キサ イ ド依 存
に, Harberlandら16)はMalondialdehyde
性 経 路 でLDLの
酸 化 を 促 進 し, そ の さ い 産 生 さ れ る
い て,
modified LDLは
ヒ ト単 球 由来 マ ク ロ フ ァー ジ(Mφ)に
す る が,
低 分 子 量 のacroleinで
修 飾 す る 濃 度 の 差 に よ っ て,
MDAに
も
acrolein-LDLのMφ さ ら
(MDA)-LDLに
お
よ る修 飾 の程 度 が軽 度 の間 は異 化 量 が 漸 減
広 汎 に 修 飾 さ れ る と, そ れ は 修 飾 の 程 度 に依 存 せ
よって 異化 され る こ と を報 告 した4).糖 化LDLやadvanced
ず に 加 速 度 的 に 増 加 す る こ と を 示 し た. また, Pearsonら17)
glycosylated end products (AGE)は い ず れ もメ ラー ド反 応 に よ って 生 成 され るが, AGEで 修 飾 さ れ た ペ プ チ ド5)は
は, Chineseハ
ム ス タ ー のovary
のscavengerレ
セ プターに よ る異化 に対 す るい ろい ろな
Mφ にお い て異 化 され る こ とが 知 られ て い る. さ らに, DM
oligodeoxyribonucleic
患 者 で は, コ ン トロー ル 群 に比 べ てAGEで
低 分 子 量 のolygodeoxyriboguanineが
LDLが
増 加 して お り, このAGEで
修飾 され た
の修 飾 はLDL粒
子の
す こ と を 報 告 し た.
酸 化 変 性 に直 接 的 に貢 献 して い る こ とが示 され た6). これ
modified
に反 し, 糖 化LDLは
の 他 の 要 因, 特 にLDLを
遷 移 金 属 イ オ ン に よ り容 易 に酸 化 さ
れ る こ とが 知 られ て い る7,8)もの の, そ れ 自体 がMφ
で直
接 異 化 され るか 否 か は明 らか で はな い. で あ る とみ な され て い
る9). In vitroでは さ まざ ま なmodified
acidの 阻 害 効 果 を 検 討 し た と こ ろ,
陰性 電 荷 の増 加 や遊 離 リジ ン の減 少 以 外 修 飾 す るsubstancesの
LDLのscavengerレ
LDLが
作 製 され,
量 の 大 き いglucoseに 糖 化LDLがMφ
有 効 な阻 害 効 果 を示
こ れ ら の 報 告 か ら, わ れ わ れ は,
分 子 量 が,
セ プ タ ー に よ る異 化 に関与 す
る の で は な い か と推 測 し た.
泡 沫 細 胞 の 形 成 は動 脈 硬 化 の 初 期 段 階 と し て重 要 な過 程 で あ り, この 細 胞 の起 源 はMφ
modified
LDLの
cellに お い て, acetyl-LDL
さ ら に 考 え を 押 し 進 め, 分 子
よ っ て 修 飾 さ れ たLDL,
のscavengerレ
す な わ ち,
セ プ ター に よ って 異 化 さ
れ る か 否 か を 明 ら か に し よ う と試 み た.
この 目的 の た め
Mφ で そ の 異 化 が 検 討 さ れ て い る. あ る 種 のmodified
に, わ れ わ れ は, glucoseを
LDLはMφ
炭 素 数 の 異 な る い くつ か の 単 糖 類 と, そ れ ら と同 様 の 構 造
*1995年11月,
のscavengerレ セ プ タ ー で取 り込 まれ, 泡 沫 細 平 成7年 度 日本 動 脈 硬 化 学 会 冬 季 大 会
(東京)に お い て発 表. 1東 京逓 信 病 院 内 分泌 代 謝 内 科, 2帝 京 大学 医学 部 第一 内科
を 有 す るglycolaldehydeを を作 製 し, Mφ
含 む, ア ル ドー スD系
列 に 属 し,
用 い て, 新 し いmodified
で の 異 化 を 検 討 し た.
LDL
118
動 脈 硬化
II.
方
No. 3
1996
法
LDL(d=1.019∼1.063g/ml)の 法18)に よ っ て 行 っ た.
Vol. 24
分 離 は, Chungら
ま た, 蛋 白 量 はLowryの
の方
方 法4)に
よ っ て 測 定 し た. LDLを
修 飾 す るaldehydeお
単 糖 類 と して, hyde(C3),
と を5%
glycolaldehyde(炭
erythrose(C4),
を 用 い た.
素 数2;C2),
arbinose(C6),
列 の
glyceralde-
お よ びglucose(C6)
こ れ ら の 各 種 のsubstancesと125I-labeled
CO2を
含 む37℃
置 し た の ち, 1mM
のincubatorで
EDTAを
4℃ で 透 析 し, 125I-labeled new Ox-LDL,
よ び ア ル ドー スD系
acetyl-LDLお
LDL
さ ま ざ まの時 間 孵
含 む 大 量 のPBSで24時 modified
LDLを
よ びAGE-albuminの
間,
作 製 し た. 作 製 は 既 報4)
に よ っ て 行 っ た. こ れ ら のmodified studyに
異 化 をMφ
よ っ て 検 討 し た19). 遊 離
trinitrobenzensulfonic 荷 電 は,
LDLの
acid (TNBS)
のdegradation Fig. 1
リ ジ ン の 減 少 は,
assay20)を,
ま た,
陰性
LDLの
between
hydes
monosaccharides,
and
reactivity.
LDL
(1mg/ml)を
LDLと
性 は 減 少 し,
果
Modified
を, 48時 間 孵 置 し, さ ま ざ ま の 時
飽 和 曲 線 を 描 い た.
性(native
電 気 泳 動 の 移 動 度 を評 価 し た. dehydeの
LDLを100%と
Table 1
性 は,
これ ら は 修 飾 す るglyceral-
Relationship
between
arabinose-LDL
and
間
%TNBS
reactivity,
glycosylated
は500mMのglucoseとLDLと
LDL. を,
非 存 在 下 で 孵 置 し てmodified modified
LDLを
は μg/mg
proteinで
と の5時 表 示)
the
degradetion
of
200mMのarabinoseま 5日
LDLを
用 い てdegradationが
のdegradationはMφ
and
た
間NaBH3CNの 作 製
存 在 下,
し た.
検 討 さ れ た.
10μg/mlの 125I-lipoprotein
間 の 孵 置 後 に 測 定 さ れ た.
Arabinose
native
LDL
し た 相 対 値 と し て 算 出 し た.
した)と
濃 度 と孵 置 時 間 に 依 存 し て 変 化 し, ほ ぼ24時
修 飾
そ れ ぞ れ200mM, 500 LDLと5日 間 孵 置 し た.
LDLの%TNBS活
の そ れ を100%と
間pointsで%TNBS活
LDLを
濃 度 に 依 存 し て%TNBS活
(■)とglucose(○)は mMの 高 濃 度 で,
単 糖 類 と の 至 適 反 応 条 件 を 決 定 す る た め に,
LDLとglyceraldehydeと
alde-
%TNBS
さ まざ まの濃 度
孵 置 し た.
す るsubstancesの
結
of
and
glyceraldehyde(●)ま
た はerythrose(▲)と
修 飾 の 程 度 を 評 価 し た. III.
concentrations
のglycolaldehyde(△),
ア ガ ロ ー ス 電 気 泳 動 上 の 移 動 度21)を 用 い て 測 定
し, modified
Relationship
(異 化 量
LDLのMφ
後 に は プ ラ トー に 達 し た が, 安 定 し たmodified 製 す る た め, 孵 置 時 間 は48時 LDLとglycolaldehyde,
間 と し た(dataは
glyceraldehyde,
置 す る と, substancesの
erythroseと
濃 度 依 存 性 に%TNBS活
よ びglucoseのLDLと
あ る た め, 高 濃 度 のarabinose mM)で5日
作
を孵
性 は50%
は,
119
そ れ ぞ れ2.22, 50.1で あ っ た(Fig.
50mMのglycolaldehydeお たmodified
LDLを
degradation
3).
よ び単 糖 類 を 用 い て 作 製 し
使 用 し てMφ
studyを
に お け るdose-response
行 っ た と こ ろ,
acetyl-LDL,
1). し か し,
の 反応 性 は ゆ る や か で (200mM)とglucose
間 孵 置 し て も, %TNBS活
(500
性 は そ れ ぞ れ73.3%,
76.3%に 低 下 し た の み で あ っ た(Fig. こ れ ら のdataを
LDLを
示 さ な い).
以 上 低 下 し, 最 終 的 に プ ラ トー に 達 した(Fig. arabinoseお
にお け る異 化 機 構
1, Table 1).
用 い て, 1/〔s〕と1/ΔTNBS(ΔTNBSは,
native LDLの%TNBS活
性(100%)か
の そ れ を 引 い て 算 出 し た)と
ら, modified
でdouble
receprocal
LDL plotを
行 っ た と こ ろ, こ れ ら は 反 応 直 線 の 傾 きが 異 な る も の の, Y 軸 上 で は 同 一 点 を通 る こ と が 示 さ れ た. こ れ ら の 反 応 は, Km値,
以 上 の 事 実 か ら,
す な わ ち 反 応 速 度 は 異 な る が, 反
応 の メ カ ニ ズ ム は 同一 で あ る と い う こ とが 明 ら か と な っ た (Fig. 2). ΔTNBSの 係 に あ り, hydeお
増 加 と電 気 泳 動 上 の 移 動 度 の 増 加 と は 並 行 関 この こ と は, 今 回 の 実 験 で 選 択 し たglycolalde-
よ び 単 糖 類 の す べ て に お い て 同一 で あ っ た. す な わ
ち, これ ら のsubstancesはLDLと
Relationship
between
electrophoretic
反 応 し た の ち, 同 じ程 度
の 陰 性 荷 電 を与 え る と思 わ れ る. Positive controlと 用 し たacetyl-LDLの
Fig. 3
(△),
して 使
ΔTNBS
mobility.
(○)の
relative
glyceraldehyde-LDL(●),
erythrose-LDL(▲)の
相 対 的 電 気 泳 動 度 お よ び ΔTNBS値
and
Glycolaldehyde-LDL お
移 動 度 は,
そ れ を1.0と
natve
よ び LDL
し, そ れ に 対 す る 相 対 値 と
し て 計 測 し た.
Fig. 2
Double
reciprocal plot constructed from
and 1/ΔTNBS. hyde
(△), glyceraldehyde
rose (▲)がLDLと
1/〔S〕
さ ま ざ ま の 濃 度 のglycolalde(●), ま た はeryth-
孵 置 さ れ た.
して, 1/〔S〕 と1/ΔTNBSが
それ を元 に
プ ロ ッ ト さ れ た.
Fig. 4
Dose-response with LDL
degradation
differing
aldehydes
LDLs
modified
monosaccharides.
(1mg/ml)と50mMのglycolaldehyde
〔S〕はLDLを 修 飾 す るsubstancesの 濃 度 を示 す. ΔTNBSは, native LDLの%TNBS活 性
(△), glyceraldehyde
(100%)か らmodified LDLsの 相対 値 を引い て 算 出 し た. 傾 き は異 な る が, お の お の の 直 線
Basuら
は, Y軸
定 さ れ た.
上 の 同 一 点 を 交 差 す る.
of and
と を48時
(●)ま
間 孵 置
し た.
た はerythrose Acetyl-LDL
の 方 法 で 作 製 し た.
degradationは,
Mφ
と の5時
(▲) (■)は
125I-lipoproteinの 間 の孵 置 の後 測
120
動脈硬化
glycolaldehyde-LDL,
glyceraldehyde-LDLはnative
り よ り 多 く 異 化 さ れ た が, 量 で あ っ た(Fig.
LDLよ
erythrose-LDLは
同程 度 の 異 化
4).
125I-glyceraldehyde
-LDLのdegradationに
ま の 非 標 識ligandに acetyl-LDL,
Vol. 24
対 す る さ ま ざ
よ る 競 合 阻 害 実 験 を 行 っ た と こ ろ,
No. 3
1996
LDLのdegradationを
完 全 に 阻 害 し た が,
よび
わ ず か に 阻 害 し た だ け に す ぎ ず,
ま た,
native LDLは
ま っ た く阻 害 効 果 を示 さ な か っ た(Fig.
5).
50mMのerythroseでmadifyし native LDLの
たLDLの
異 化 量 は
そ れ と ほ ぼ 同 程 度 で あ っ た た め, さ ま ざ ま の
濃 度 で 修 飾 し たerythrose-LDLを
glycolaldehyde-LDLは125I-glyceraldehyde-
Ox-LDLお
AGE-albuminは
aldehyde-LDLのdegradationに た. Erythrose-LDLは,
作 製 し,
修 飾 す るerythroseの
こ のdegradationを
125I-glycer-
対 す る 阻 害 効 果 を検 討 し
阻 害 し た(Fig.
濃 度 依 存性 に
6).
さ ら に, 125I-glyceraldehyde-LDLのdegradationに fucoidinの
阻 害 効 果 を 検 討 し た と こ ろ,
よ っ て 完 全 に 阻 害 さ れ た(Fig. Fig. 4∼7の
よ びerythrose-LDLはMφ
レ セ プ タ ー か ら取 り込 ま れ る こ とが 示 唆 さ れ た.
これ ら3 modified
LDLも
修 飾 濃 度 を 変 え て 作 製 したnew studyを
erythrose-LDL,
labeled
ligands
to
concentrations
the
glyceraldehyde-LDL.
degradation
un-
of
125I-
125I-glyceralehyde-LDL
(5μg/μl)のdegradationに ligandsの
of
対 して さ ま ざ まの
さ ら に, ΔTNBSと
Competition modified rose LDL. 48時
to
study with
the
unlabeled
れ も ΔTNBSの
degradation
of
間 孵 置
し て,
し,
のerythroseと
性
値 が 軽 度 の 場 合 は, 異 化 量 はnative
LDL
こ の さ い,
値 が 同 程 度 で あ っ て も異 化 量 に は 差 が み ら れ,
を の 異
な る
125I-glyceraldehyde-
100mM(●)
孵 置 さ れ た.
8).
異 化 量 の 関 係 を検 討 し た と こ ろ, い ず
of eryth-
対 す る 阻 害 効 果 を 検 討 し た.
そ れ ぞ れ50mM(○),
さ ら に その 頂 値 も
125I-glyceraldehyde-
%TNBS活
作 製
glycolaldehyde-LDL
り増 加 し,
LDLs
concentrations
異 な っ た 濃 度 のerythroseとLDLと
erythrose-LDLを LDLに
of
differing
LDLよ
よ り減 少 し, そ れ が 高 度 の 場 合 は 増 加 し た.
阻 害 効 果 を 検 討 し た.
LDL
広 汎 に修 飾 さ れ た 場 合 の そ れ は
こ の 順 に 高 値 と な っ た(Fig.
ΔTNBSの
Fig. 6
い ず れ のmodified
glyceraldehyde-LDL,
の い ず れ もがnative of
行 っ た.
低 濃 度 で 修 飾 さ れ た 場 合 の 異 化 量 は, native
の 異 化 量 よ り減 少 し た が,
study
glycerのscavenger
つ のsubstancesの LDLのdegradation
Competition
こ れ はfucoidinに
7).
結 果 か ら, glycolaldehyde-LDL,
aldehyde-LDLお
Fig. S
対す る
LDLは
150mM(△)
Fig. 7
Competition tion
of
study
of fucoidin
125I-glyceraldehyde-LDL.
to the
degrada-
125I-glycer-
aldehyde-LDL(5μg/ml)のdegradationに す るfucoidin(○)の
阻 害 効 果 を 検 討 し た.
対
LDLのMφ
にお け る異 化 機 構
121
め る と と も に, 還 元 物 質 で あ るNaBH3CNを な 修 飾 を 行 っ た. %TNBS活
し か し,
用 い て, 広 汎
こ れ ら のmodified
LDLは
性 を 低 下 さ せ れ ば さ せ る ほ ど異 化 量 が 減 少 す る
こ とが 示 さ れ た(Table 1). IV. DMで
考
案
は動 脈 硬 化 性 疾 患 の 合 併 す る こ とが 多 く1,22),そ の
理 由 の一 つ と し て 糖 化LDLの
動 脈 硬 化 惹 起 の 可能 性 が 示
唆 さ れ て い る. さ ま ざ ま のmodified
LDLがMφ
のscaven-
gerレ セ プ タ ー で 取 り込 ま れ, 泡 沫 細 胞 を 形 成 す る こ と が 動 脈 硬 化 発 生 の もっ と も 重 要 な 過 程 と み な さ れ て い る2,3,23,24). し か し な が ら, modified LDLがMφ
のscavengerレ
LDLの一
つ で あ る糖 化
セ プ ター で 取 り込 まれ る か 否
か は 議 論 の あ る と こ ろ で あ る. Fig. 8
Relationship stances
between
and
the
degradation.
のglycolaldehyde
of
(▲)とLDLを48時
Degradation
sub-
さ ま ざ まの濃 度
(△), glyceraldehyde
た はerythrose た.
concentrations
(●),
ま
間 孵 置
し
studyは125I-lipoproteinを
い て な さ れ た. 破 線(---)は125I-native
用 LDLの
異 化 量 を 示 す.
わ れ わ れ は,
LDLとglyceraldehydeと
遇 然 にglyceraldehyde-LDLが た.
さ ら にpreliminary
と 糖 化LDLのMφ と こ ろ,
を 孵 置 し た さ い,
形 成 され る こ と を見 い 出 し
studyと
し て,
glyceraldehyde-LDL
に お け るdegradation
glyceraldehyde-LDLの
増 加 す る が, 糖 化LDLは こ の 両substancesは
studyを
異 化 量 はnative
行 った
LDLよ
り
減 少 す る とい う結 果 が 得 ら れ た.
い ず れ も ア ル ドー スD系
列 の単 糖 類
に 属 す る た め, 分 子 量 の み が 異 な り, 二 重 結 合 を 有 さ な い, 同 系 列 の 比 較 的 単 純 な 構 造 を 有 す るglycolaldehyde glyceraldehyde (C6)を
(C3), erythrose (C4), arabinose
用 い て, modified
dation studyを 行 っ た. substancesの
LDLを
作 製 し, Mφ
(C5), glucose に よ るdegra-
こ の 実 験 に よ り, LDLを
分 子 量 がscavengerレ
(C2),
修飾す る
セ プ ター の 異 化 に お よ
ぼ す 影 響 を 検 討 し, 糖 化LDLの
異 化 機 構 を推 察 す る こ と
と し た. ま ず, Fig. 1に 示 す よ う に, LDLとglycolaldehyde, aldehyde, erythroseと の 孵 置 に よ り, %TNBS活
glycer性 は, 時 間
お よ び 濃 度 依 存 性 に低 下 し, そ の 後 プ ラ トー に 達 した. か し, arabinoseとglucoseは,
し
還 元 物 質 が な け れ ば, 遊 離
リ ジ ン を 広 汎 に 減 少 さ せ る こ と が で き な か っ た(Fig. Table 1). Double
hyde, glyceraldehydeお Fig. 9
Relationship tion.
between
こ の 検 討 は,
ΔTNBS Fig. 8に
に し て な さ れ た. LDL LDL LDLの
示
the degrada-
あ る実 験 結 果 を元
そ れ ぞ れglycolaldehyde-
(△), glyceraldehyde-LDL (▲)を
and
す.
(●), erythrose-
破 線 (---)は125I-native
よ びerythroseと
の 反 応 は 同一 の 機
序, す な わ ち メ ラ ー ド反 応 に よ る と考 え られ た(Fig. た,
1,
reciprocal plotに よ り, LDLとglycolalde-
これ ら のsubstancesはLDLに
2). ま
同一 の 陰 性 荷 電 を 与 え
る と思 わ れ, 電 気 泳 動 上 の 移 動 度 も遊 離 リ ジ ン の 減 少 と関 連 す る こ と が 示 さ れ た(Fig.
3).
異 化 量 を 示 す.
LDLと50mMのglycolaldehyde,
glyceraldehyde,
eryth-
roseと を 孵 置 す る こ と に よ っ て 作 成 さ れ たglycolaldehydeerythrose-LDL,
glyceraldehyde-LDL,
の 順 に そ の 量 は 増 加 し た(Fig. Arabinose-LDLと
糖 化LDLは,
glycolaldehyde-LDL
LDLとglyceraldehyde-LDLの acetyl-LDLよ
9). 還 元 物 質 の非 存 在 下 で
は. 遊 離 リ ジ ン の 減 少 が 少 な い た め. substancesの
濃 度 を高
異 化 量 はpositive
り減 少 す る が, native LDLよ
か し, erythrose-LDLはnative (Fig. 4). こ れ ら のmodified
LDLと LDLは,
controlの
り増 加 し た. し ほ ぼ 同等 で あ っ た
修 飾 す るsubstancesの
122
動 脈 硬化
Vol. 24
No. 3
1996
濃 度 に よ っ て 修 飾 の 程 度 を変 え る と, い ず れ も軽 度 の 修 飾
よ っ て 修 飾 さ れ たLDLやalbuminはMφ
時 に は, 異 化 量 がnative
ま れ る こ とが 報 告 さ れ て い る25,26)ま た, Zhangら24)は,
に な る と増 加 し た.
LDLよ
し か し,
hydeとglyceraldehydeで 緩 徐 で あ っ た(Fig.
り減 少 す る が, 修 飾 が 高 度 この 増 加 の 程 度 はglycolalde-
は 急 峻 で あ っ た が, erythroseで
8). こ の 異 化 量 の 推 移 に つ い て は, い く
つ か の 過 去 の 報 告 か ら, modified がLDLレ
LDLの
セ プ タ ー か らscavengerレ
レ セ プ ター 認 識
セ プ ター へ 移 行 した
もの と推 測 で き る13,16,24). Basuら25)は, LDLと
し てacetyl-LDLを
LDLレ た.
は
作 製 し,
は じ め てmodified これ は線 維 芽 細 胞 の
セ プ タ ー で, 認 識 さ れ な く な る とい う こ と を 報 告 し そ の 後,
albuminが
さ ま ざ ま の 化 学 修 飾 さ れ たmodified
作 製 さ れ,
scavengerレ
こ れ ら はLDLレ
LDLや
セ プ タ ー で は な く,
セ プ ター で 認 識 さ れ る こ とが 明 らか に さ れ
た12,13,15,25-27). た と え ば, Harberland16)ら 作 製 し た さ い, native LDLの
は, MDA-LDLを
こ の 異 化 量 がMDA/LDL比28:1ま
で は
異 化 量 よ り低 下 す る も の の, さ ら に 修 飾 が 進
に よ く取 り込
ラ キ ド ン 酸 や リ ノ ー ル 酸 の 過 酸 化 物 を 用 い たLDLの お よ び 取 り込 み 実 験 か ら, modified
LDLのMφ
修飾
への取 り
込 み は, 遊 離 リ ジ ン の 減 少 の み で 説 明 で き る と し て い る が, 彼 らの 実 験 系 で は, 脂 質 の 過 酸 化 の 過 程 に お い て, 短 鎖 か ら 長 鎖 の さ ま ざ ま な 分 子 量 のaldehydesが れ30), よ っ て 作 製 さ れ るmodified aldehydesに modified
LDLもheterogenousな
よ っ て 修 飾 さ れ る こ と に な り,
LDLの
hydesの
産 生 さ
この さ い の
取 り込 ま れ や す さ は, 短 鎖 と長 鎖 のalde-
比 率 に よ っ て 異 な っ て く る の で は な い か と考 え ら
れ る. Pearsonら17)は,
1251-acetyl-LDLのscavengerレ
セプ
ター を 介 し た 異 化 に 対 す る さ ま ざ ま のoligodeoxyribonucleic
acidsの 阻 害 効 果 を 検 討 し, 低 分 子 量 の も の
(dGnのn数
が5≦n≦37)が
阻 害 効 果 が 強 い こ と を報 告 し
た. わ れ わ れ の 仮 説 が 正 し い とす れ ば, MDA-LDLの
異化
む と, そ の 後 の 修 飾 の 程 度 に は 無 関 係 に 異 化 は 加 速 度 に 増
の 特 徴 を 次 の よ う に 考 え る こ と が で き る. MDAは1分
加 す る こ と を 示 し た.
ま た, Heineckeら28)も,
で メ ラ ー ド反 応 に よ っ て2つ
mediated
お い て,
oxidative LDLに
い 出 し て い る.
thiol-
同様 の 異化 の変 化 を見
これ ら の 事 実 は 前 述 の わ れ わ れ の 推 測 を 裏
ア
のLDL粒
子
子 と結 合 す る こ と
が 可 能 で あ り, ゆ え に も と も と低 分 子 量 で あ るMDAの
分
子 量 は 実 際 の1/2と
み
い う き わ め て 低 分 子 のaldehydeと
づ け る も の と思 わ れ る. 実 際, わ れ わ れ は, glyceraldehyde-
な す こ とが で き, そ の 結 果 レ セ プ タ ー 認 識 が 変 わ っ た の
LDLの
異 化 に 対 す る 競 合 阻 害 実 験 に よ り, こ のmodified
ち, 加 速 度 的 な 異 化 を 示 し う る.
LDLが
い わ ゆ るacetyl-LDLレ
よ り, 高 分 子 量 のarabinoseやglucose修
る こ と を 証 明 し た(Fig. 一 方,
セ プ ター に よ って 異 化 され
5∼7).
のscavengerレ
GoldsteinとBrown11)は,
の 認 識 の た め に は, LDLの
scavengerレ
陰 性 荷 電 が も っ と も重 要 で あ る
と述 べ て い る が, Harberlandら12)は, が,
セ プ ター で
それ が重 要 で は あ る
そ れ の み で は 充 分 で は な く, 遊 離 リ ジ ン の 減 少 が 何 よ
り も有 用 で あ る と報 告 し た.
Goldsteinら11)も
陰性荷電 の
また,
さ ら に こ の仮 説 に 飾 のLDLはMφ
セ プ タ ー で は 認 識 さ れ な い と 推 測 さ れ,
わ
れ わ れ の デ ー タ を 良 く説 明 し う る(Table 1). 糖 化LDLの
異 化 が どの よ うに な され るの か は充 分 知 ら
れ て い な い. 動 物 実 験 に よ る と, 糖 化LDLはscavengerレ セ プ ター で は異 化 さ れ ず,
レセ プ タ ー非 依存 性 経 路 を介 す
る の で は な い か と考 え ら れ て い る31). ほ とん ど のin
vitroの
重 要 性 は 認 め な が ら も, 同 一 の 陰 性 荷 電 を与 え る 修 飾sub-
実 験 は, 線 維 芽 細 胞 を 用 い て な さ れ て い る32,33)が, 糖 化
stancesで も, あ る も の はMφ
LDLの
に よ く取 り込 ま れ, 他 の もの
異 化 は, LDLの
修 飾 の さ い に 還 元 物 質 を 用 い て も,
は取 り込 ま れ な い と い う事 実 を 観 察 し て い る. わ れ わ れ も
そ うで な くて も, 遊 離 リ ジ ン の 修 飾 の 増 加 と と も に 減 少 し
当 初,
て い る34).最 近, Crericheら35)は,
Fig. 8で み ら れ たglycolaldehyde-LDL,
hyde-LDL,
erythrose-LDLの
glyceralde-
異 化 の 頂 値 差 は, 遊 離 リ ジ ン
を 孵 置 し て 糖 化LDLを
50mMのglucoseとLDL
作 製 す る と, こ の 異 化 量 はnative
の 減 少 の 差 に よ る も の で は な い か と考 え た. し か し, Fig. 9
LDLよ
の 結 果 か ら, 今 回 用 い たsubstancesに
る も の で あ る こ と を 報 告 し た. わ れ わ れ は, arabinose-LDL
modified
LDLのscavengerレ
よ って 作 製 さ れ た
セ プ タ ー 認 識 に は, 陰 性 荷 電
の 増 加 や 遊 離 リ ジ ン の 減 少 だ け で は な く, 他 の 要 因, わ ち, LDLを
修 飾 す るsubstancesの
分 子 量 も関与 して い る
の で は な い か と思 わ れ た. Steinbrecherら15)は, 修 飾 し たLDLはscavengerレ れ ら の 異 化 量 はnative
す な
aldehydeで
セ プ タ ー で は 認 識 さ れ ず, こ LDLの
そ れ よ り も減 少 す る と 述 べ
た が, 彼 ら の デ ー タ を 検 証 す る と, 低 分 子 量 のacroleinで 修 飾 し て も, 10mMの り減 少 す る が, れ て い る.
100mMの
低 濃 度 で はnative
LDLの
異化量 よ
高濃 度 で は増 加 す る こ とが 示 さ
ま た, 他 の 研 究 者 に よ る 報 告 で も, aldehydeに
り減 少 し, か つ そ の 異 化 はLDLレ
と糖 化LDLを
作 製 す る さ い, 還 元 物 質 を 用 い な け れ ば, か
な り 高 濃 度 のarabinoseやglucoseを LDLの
用 い て も, 充 分 な
遊 離 リ ジ ン の 減 少 が 得 られ ず, 結 果 と し て これ ら の
modified し た.
セ プ タ ー を介 す
LDLの
異 化 はnative
そ れ ゆ え,
LDLよ
り減 少 す る こ と を 示
さ ら に 還 元 物 質 を 用 い て, 広 汎 な 遊 離 リ
ジ ン の 減 少 を ひ き お こ し た と こ ろ, 異 化 量 の さ ら な る減 少 を きた した(Table 1). ま た はaromatic
Horiuchiら36)はaliphatic
aldehyde単
元 物 質 の 存 在 下,
aldehyde
独 の 場 合 と, さ ら に これ ら と還
非 存 在 下 で 修 飾albuminを
formaldehyde-albuminのdegradationに
作 製 し,
対 す る効 果 を検 討
LDLのMφ した とこ ろ, い ず れ も充 分 なLDLの
にお け る異 化 機 構
遊 離 リジ ンの 減 少 を
来 た した もの の, aliphaticaldehyde単 独 の場 合 は阻 害 効 果 を発 揮 した が, その 他 の場 合 に は それ が み られ な い こ とを
9)
報 じた. これ らの こ とは, 還 元物 質 を用 いて 作 製 したaldehydeあ る い は単糖 類 に よ るmodified LDLは,
scavengerレ
10)
セ プ ター のligandに な りえ な い こ とを示 して い る と思 わ れ る. Native LDLやmodified
LDLの
レセ プ タ ー を介 した
11)
異 化 に は, 粒 子 サ イ ズ37,38)や 三 次構 造39,40)が 重要 であ ると の報 告 もあ り, こ う した見 解 を支 持 す る事 実 で あ る と考 え られ る. DMの
12) 動 脈 硬 化 性 合 併 症 の多 くは高 血 糖 に よ る も の で
あ る とい う多数 の証 拠 が み られ, 高 血糖 の結 果 生 成 され る AGEは
それ を惹 起 す る もっ とも重 要 な物 質 の一 つ とみ な
され て い る5).わ れ わ れ は, glucoseが ス ーパ ーオ キサ イ ド依 存 性 経 路 に よ ってOX-LDLを
生 成 し, これ がMφ
て異 化 され る こ とを報 告 した4). 一方, 糖 化LDLが
13)
に よっ 遷 移金
属 イ オ ン に よ って 容 易 に酸 化 さ れ る こ と も知 られ て お り7,8),このmodified LDLがscavengerレ
セ プ ター を介 して
14)
異 化 され な い とい う今 回 の事 実 を あ わ せ 考 え る と, 糖 化 LDLは,
LDLの
酸 化 変性 経 路 を介 して 泡 沫細 胞 の形 成 に
関与 して い る ので はな い か と思 わ れ る.
15)
文
献
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LDLのMφ
にお け る異 化 機 構
125
Summary
Foam
Cell
Formation
through
of Glycosylated
Mitsunobu
KAWAMURA1, Shigeru and
2The First
Low
Makoto
Oxidative Density
Modification
Lipoprotein
MIYAZAKI1, Tamio
TERAMOTO2,
KINOSHITA2
1 Department of Internal Medicine, Tokyo Teishin Hospital, Tokyo, Japan Department of Internal Medicine, School of Medicine, Teikyo University, Tokyo,
Using glycolaldehyde (two carbons, C2) and monosaccharides of the aldose D series, i.e., glyceraldehyde (C3), erythrose (C4), arabinose (C5), and glucose (C6), new modified low density lipoproteins (LDLs) were
Japan
produced to determine if degradation of modified LDLs
glyceraldehyde-LDL changes from the LDL receptor to the scavenger one. Degradation of new modified LDLs appeared to depend on a decrease in the percentage of TNBS reactivity. Further, even though these modified LDLs
by
showed
the
human
monocyte-derived
macrophage
(Mφ)
scavenger receptors is based on the molecular weight of the substance used to modify the LDL free lysine. By using a trinitrobenzensulfonic acid (TNBS) assay, it was found that the smaller the molecular weight of the substances used for LDL modification, the more rapid and extensive is the decrease of free lysine, which plateaued after 24h. Based on findings of glycolaldehyde-LDL, glyceraldehyde-LDL and erythrose-LDL, double reciprocal plots were made. Results revealed that all three reactions occured through the same mechanism, although the Km values in the three modified LDLs differed. Further, the electrophoretic mobility of these modified LDLs correlated with a decrease in the percentage of TNBS reactivity. Using
Mφ,
degradation
studies
of
mildly
modified
LDLs revealed that, in contrast to native LDL, little degradation occured. However, after extensive modifications, less degradation was seen in glycolaldehydeLDL, glyceraldehyde-LDL and erythrose-LDL than in the acetyl-LDL, but more degradation occured in these new modified LDLs than in native LDL. Further, degradation of 125-I-glyceraldehyde-LDL was remarkedly inhibited in unlabeled acetyl-LDL, 125-Iglycolaldehyde-LDL and fucoidin, whereas in unlabeled oxidized LDL and advanced glycoslation end products(AGE)-modified bovine serum albumin, degradation of 125-I-glyceraldehyde-LDL was extremely slight. In contrast, unlabeled native LDL produced no inhibitory effect on the degradation of 125-I-glyceraldehydeLDL. These findings would seem to suggest that after extensive modification, receptor recognition of
the
same
ΔTNBS
decrease,
these
degradation
progressively increased in the following order: erythrose-LDL. glyceraldehyde-LDL, and glycolaldehyde-LDL, These findings suggest that the degree of LDL degradation is not only associated with an increase in the negative charge and decrease in the percentage of TNBS reactivity, but also with the molecular weight of the substance used to modify the LDLs. Arabinose-LDL and glycosylated LDL showed less degradation than native LDL, although LDLs were incubated for 5 days with a high concentration of their respective modifying substance. Degradation decreased even further when NaBH3CN was used for extensive LDL modification. These findings suggest that the particle size and/or the stereoscopic strucure of modified LDLs may play an important role in becoming the ligand of the scavenger receptor. Glucose promotes oxidative LDL modification. Further, glycosylated LDL are easily oxidized by metalic ions, and oxidized LDL are extensively degraded by the scavenger receptors. However, our results have demonstrated that glycosylated LDL is not recognized by the scavenger receptors even after extensive modification. We thus have speculated that under hyperglycemic conditions, LDLs may promote the formation of foam cells as not only AGE but also oxidized and/or glycoxidized LDLs. Key words:Modified low density lipoprotein, Glycosylated low density lipoprotein, Oxidized low density lipoprotein, Human-monocyte derived macrophage, Atherosclerosis
