Recherches sur le role de la temperature dans la ... - Development

/. Embryo!, exp. Morph. Vol. 34, 1, pp. 221-252, 1975 Printed in Great Britain

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Recherches sur le role de la temperature dans la realisation du phenotype chez des embryons de TAmphibien Pleurodeles waltlii homozygotes pour la mutation thermosensible ac (ascite caudale) Par MARIA FERNANDEZ1 et JEAN-CLAUDE BEETSCHEN1 Laboratoire de Biologie generate (Equipe de Recherche associee au CNRS n° 327), Universite Paul-Sabatier, Toulouse, France

SUMMARY 1. At the feeding stage (st. 38), a high percentage (79 %) of Pleurodeles homozygous ac/ac larvae show bent tails after a persistent ascitic blister in the dorsal part of the fin, when embryonic development occurred at 12°C; about only 25 % of them are affected by abdominal and pericardic ascites; about 40 % can feed and survive. The larval phenotype is very different when embryonic development occurred at 23 °C, in which case tail growth appears to be normal, but 95 % larvae die, due to ascitic fluid collection in the abdominal and heart regions, marked anaemia and microcephaly. 2. The exchange of posterior neural plates and dorso-lateral epidermis between normal and mutant neurulae has shown that the localization of the blister in the dorsal fin is not dependent on autonomous properties of the mutant dorsal tissues, but should be considered as resulting from general disturbances in the mutant organism. 3. Experiments were performed, involving a temperature shift from 12 to 23°C or 23 to 12°C, occurring at various developmental stages from the end of gastrulation (stage 13) to the stage of spontaneous embryonic muscle contractions (stage 26). When the temperature shift was applied after the end of neurulation (stage 21), the caudal phenotype was statistically similar to that of larvae which had been bred continuously at the first temperature. Thus temperature-sensitive phases can be characterized between neurula stages 15 and 18 (for a 12-23° shift) or 15 and 21 (for a 23-12° shift). Similarly, abdominal ascites can be induced when embryos are kept at 23 °C till stage 23 (early tail-bud) only, and occurs much less frequently when embryos are kept at 12°C till stage 23 and then transferred to 23°C. 4. It could be concluded from these experiments that the caudal mutant phenotype is already temperature-determined during neurulation, before stage 21. Nevertheless, double temperature-shift experiments showed that the second shift could modify the results which would be obtained if the first shift only occurred. Paradoxical results were obtained, more than 90 % of the tail phenotypes being of the 'warm type' when the embryos were first kept at 12°C, then shifted up to 23 °C between stages 22 and 26, and shifted down again to 12°C. Such a treatment markedly lowers the percentage of bent tails ('cold type') from the percentage which would occur if acjac embryos were constantly kept x Adresse des auteurs: Laboratoire de Biologie generate, Universite Paul-Sabatier, 118 Route de Narbonne, 31077 Toulouse-Cedex, France.

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M. FERNANDEZ ET J. C. BEETSCHEN

at 23 °C after stage 21, but this longer warm treatment is of no effect of itself as compared to the case when the whole development occurs at 12°C (bent tails are predominant in this latter case). Thus, whereas the early determination of the position of the caudal blister can be considered as a stable phenomenon under given temperature conditions, it is not irreversible. 5. As compared to cold-bred larvae, thrice as many completely anaemic larvae (66 %) were obtained from ac/ac embryos kept at 23 °C between stages 21 and 26; this offers an opportunity for the experimental study of this anaemia. 6. Implications of these results for further analysis of temperature-sensitive mutations in cold-blooded vertebrates are suggested.

INTRODUCTION

Chez la Drosophile, les mutations thermosensibles constituent une source de materiel particulierement interessante pour deceler les phases du developpement au cours desquelles intervient la determination d'une ebauche embryonnaire: celle-ci n'est plus affectee par le changement de la temperature a partir d'un stade de developpement donne, caracteristique de l'organe considered L'emplacement et la duree des phases thermosensibles sont variables (Suzuki, 1970; Foster, 1973). L'existence de telles mutations thermosensibles chez les Vertebres poikilothermes devrait de meme permettre d'introduire une nouvelle methode d'approche dans l'analyse experimental de leur developpement embryonnaire. Mais, bien que le nombre de mutations connues chez les Amphibiens Urodeles, en particulier chez l'Axolotl, soit deja relativement eleve (Briggs, 1973; Malacinski & Brothers, 1974), la plupart ne paraissent pas manifester une thermosensibilite utilisable pour une telle analyse. L'une d'entre elles a cependant ete mise en evidence chez Pleurodeles waltlii; la mutation recessive semi-lethale 'ascite caudale' ac (Beetschen & Jaylet, 1965) s'est revelee en effet thermosensible: le phenotype des larves issues d'embryons eleves a 23 °C est beaucoup plus anormal que celui des larves issues d'embryons eleves a 12 °C, dont 40 % environ peuvent survivre, et la temperature de 23 °C entraine ainsi la mort de plus de 95 % des larves mutantes peu apres l'eclosion (Beetschen, 1971). En outre, la mutation ac induit l'apparition d'un 'effet maternel' dans la descendance des femelles ac/ac (Beetschen, 1970), qu'on peut rapprocher des effets maternels deceles pour les mutations/, v, o et cl de l'Axolotl (Humphrey, 1960, 1962, 1966; Briggs & Humphrey, 1962; Briggs & Cassens, 1966; Briggs, 1972, 1973; Carroll & Van Deusen, 1973). A partir de ces donnees, nous avons entrepris une etude approfondie de diverses modifications phenotypiques des larves mutantes ac/ac, sur la base d'un seul changement de temperature intervenant a tel ou tel stade du developpement embryonnaire. L 'application de deux changements successifs de temperature, qui intercalent une periode de developpement relativement courte a temperature elevee entre deux longues periodes a temperature basse (ou reciproquement), nous a

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ensuite conduits a des constatations qui montreront la complexite des phenomenes de thermosensibilite existant en realite chez un organisme superieur poikilotherme. Le present travail expose l'ensemble des resultats auxquels nous sommes parvenus a l'heure actuelle par ces methodes de changement de temperature au cours du developpement embryonnaire. Nous donnerons au prealable une breve analyse experimental concernant la genese du phenotype 'ascite caudale' au cours du developpement.

MATERIEL ET METHODES

Les souches de Pleurodeles utilisees sont elevees au laboratoire depuis plusieurs annees, dans des aquariums a eau courante (Gallien, 1952). Les individus ac/ac utilises pour les experiences de changement de temperature sont obtenus a l'aide de croisements du type $ + /ac x $ ac/ac ou, a defaut, du type + /ac x +ac. Les pontes obtenues a partir des $ $ ac/ac donnent une descendance affectee par l'effet maternel, qui a ete utilisee seulement dans des experiences de greffes. Les embryons mutants sont tries des qu'ils deviennent reconnaissables, a partir du stade 30 de la table chronologique de Gallien & Durocher (1957). Tous les embryons restent dans leur gangue jusqu'au stade 34 (eclosion), tout le developpement s'effectuant dans des cristallisoirs ou des cuvettes remplis d'eau phreatique maintenue a temperature constante (12 ±0,5 ou 23 ±0,5 °C selon les cas). L'examen des caracteres phenotypiques choisis a lieu systematiquement sur le vivant aux stades 37-38, qui correspondent a la prise de nourriture chez les individus normaux. Les operations au stade neurula (lere partie) ont ete effectuees dans du liquide de Holtfreter operatoire sterile additionne d'elcosine Ciba (0,5 g %0), dans des coupelles operatoires a fond garni de pate a modeler; apres cicatrisation, les embryons ont ete transported dans du liquide de Holtfreter dilue au 1 /10 et y ont sejourne pendant 24 a 48 h, avant d'etre places dansde l'eau phreatique sterilisee par nitration, ou le developpement ulterieur s'est poursuivi jusqu'au stade 38. Les methodes particulieres utilisees pour l'analyse statistique des resultats et pour les changements de temperature seront exposees dans le texte correspondant. RESULTATS

1. Genese du phenotype ascitique Les individus mutants ac jac sont caracterises aux stades 28-29 par la presence d'ascite dans la nageoire dorso-caudale (Beetschen & Jaylet, 1965), les individus + jac etant phenotypiquement normaux. L'ascite localisee dans la nageoire a-t-elle pour origine un dereglement de 15

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Fig. 1. Echange de la plaque neurale troncale, des bourrelets medullaires et d'ectoderme dorso-lateral adjacent entre deux jeunes neurulas de Pleurodele aux stades .14-15, Tune ac/ac, l'autre + / + ou +/ac.

l'activite metabolique des tissus qui donnent naissance a cet organe, ou bien celui-ci n'est-il qu'un lieu d'accumulation du liquide ? De nombreux travaux (Raven, 1931; Holtfreter, 1933; Du Shane, 1935; Twitty & Bodenstein, 1941; Woerdeman, 1946; Horstadius, 1950; Bodenstein, 1952) ont contribue a la comprehension du mecanisme de formation de la nageoire chez les LJrodeles; celle-ci comporte deux etapes: (1) Une induction exercee par les cretes neurales sur l'ectoderme dorsal sus-jacent, certainement peu de temps apres la fermeture du tube nerveux; (2) L'ectoderme a son tour induit les cretes neurales a former le mesenchyme qui constitue le soutien de la nageoire. Ces donnees etant acquises, nous avons entrepris des greffes de l'ensemble plaque neurale troncale + bourrelets medullaires+ ectoderme adjacent, esperant repondre ainsi a la question posee. A. Protocole experimental Sur de jeunes neurulas de Pleurodele (stades 14-15), deganguees et dechorionnees, on preleve les greffons comme suit: sur la neurula donneuse, on pratique au moyen d'un fil de platine des incisions interessant uniquement le feuillet le plus superficiel, autour du fragment que Ton veut extirper. Le greffon ainsi delimite contient la quasi-totalite de la plaque neurale troncale, les bourrelets medullaires ainsi que deux lambeaux d'ectoderme dorsolateral. On detache ensuite delicatement le greflfon en prenant soin de ne pas leser les tissus sous-jacents. Une intervention analogue est realisee sur la neurula receveuse (Fig. 1). Le greffon transports dans la plaie est maintenu en place par un petit cavalier de verre. La cicatrisation achevee, les embryons operes


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sont transportes dans des coupelles contenant une solution de Holtfreter diluee au 1/10 et y sejournent pendant 24 a 48 h. Us sont ensuite places dans de l'eau phreatique. B. Result at s Deux types d'experiences ont ete effectues selon la provenance des neurulas donneuses et receveuses. (1) Les embryons donneurs sont issus d'une ponte provenant d'un croisement $ + lac x $ ac/ac et les embryons receveurs proviennent soit de la meme ponte, soit d'une ponte normale ( $ + / + x £+/ + ) . Dans ces conditions nous avons realise des echanges reciproques qui aboutissent a de meilleurs resultats (Fig. 1). En effet, dans le cas ou la greffe n'est pas reciproque, tres souvent la neurula donneuse ne se cicatrise pas a cause de l'ampleur de la blessure, et de ce fait se cytolyse. II devient des lors impossible de determiner le genotype du greffon preleve. (2) Les embryons donneurs sont issus d'une ponte provenant d'un croisement $ ac/ac x 12° (Tableau 4) aux stades correspondants. Ces series de pontes d'une meme femelle permettent d'etudier sur un materiel genetiquement aussi homogene que possible, les variations dues aux diverses experiences et de montrer leur realite en dehors de tout groupage de series issues de femelles differentes.

Nombre de larves observees

60 131 50 86 79 83 69 78 108

Type d'experience

Temoins 12 °C Temoins 23"3C 12°—st. 13 ->23° 12°—st. 16 ->23° 12°—st. 22 ->23° 12°—st. 23 ->23° 12°—st. 24 ->23° 23°—st. 19 -+12° 23°—st. 24 -+12°

Designation des series Microcephalie V) 8,0 ± 7 N3 LO! 89,7 ± 5 94,0 ± 7 I3-1 N 3 _x 98,0 ± 3 84,0 ± 8 O'8_i 92,0 ± 6 N" 3 _l O3-1 10,0 ± 7 60,0±ll I1-3 56,0 ±10 Li-3 Ascite caudale (3)

98,0 ± 4 77,9 ± 7 64,0 ±14 67,0 ±10 95,0 ± 5 96,0 ± 4 97,0 ± 4 81,0± 9 76,0 ± 8

Absence d'erythrocytes branchiaux (2)

5,0 ± 6 79,4 ± 7 90,0 ± 8 92,0 ± 6 66,0±ll 73,0 ±10 10,0 ± 7 l,0± 2 36,0 ± 9

78,0 ±10,5 19,3 ± 6,8 26,0 ±12,2 20,0 ± 8,5 72,0 ± 9,9 70,0+ 9,9 96,0 ± 4,6 42,0 ±10,9 l,0± 4,1

(4)

Croissance anormale de la queue

27,0 ±11 95,0 ± 4 86,0 ±10 98,0 ± 3 94,0 ± 5 96,0 ± 4 25,0 ±10 26,0 ±10 78,0 ± 8

(5)

Ascite cardiaque

Pourcentages observes pour les differents caracteres ±212° avec le groupetemoin a 23 °C. (/?) Ascite cardiaque (5) et abdominale (6). La serie I ^ a reagi d'une part comme la serie-temoin N 3 (12 °C), d'autre part, comme le groupe-temoin eleve a 12 °C, ainsi que comme le groupe 23°—st. 19->12°. Les resultats de la serie L±_3 concordent avec ceux obtenus pour le groupe 23°—st. 24->12°. lei encore, au meme titre que le groupe 23°—st. 24-^12° differe des groupestemoins a 12 °C et a 23 °C, la serie Lx_3 differe egalement des series-temoins a 12 °C (N3) et a 23 °C (LOX) provenant de la meme femelle. (c) Conclusion Les series realisees a partir des pontes de la $ H-68-9 ont fourni des resultats comparables a ceux qui se degagent de l'etude faite sur l'ensemble des femelles (18 $ $ au total). Une analyse semblable a ete entreprise pour chacune de ces femelles. Elle nous a montre que, si les pourcentages des phenotypes observes apres un traitement thermique donne, peuvent varier d'une femelle a l'autre (independamment de la lignee a laquelle elles appartiennent, qu'elle soit consanguine ou non) et d'une ponte a l'autre (meme quand celles-ci sont issues d'une m6me femelle), les variations observees ne sont cependant pas quelconques: on obtient toujours, par exemple, une majorite d'individus ayant soit une queue recourbee apres elevage en eau froide, soit une queue rectiligne apres elevage en eau plus chaude. (4) Discussion Les experiences de changement de la temperature d'elevage a des stades varies du developpement embryonnaire nous ont ainsi permis de montrer qu'il existe des stades au cours desquels un changement de temperature entraine des modifications du phenotype chez les mutants ac/ac, et des stades critiques apres lesquels ces modifications n'interviennent plus. Ainsi, lorsque un transfert de 12 a 23 °C intervient au stade 18 ou a un stade ulterieur, il n'est plus possible de modifier la morphologie ulterieure de la queue, qui sera courbee vers le haut. Nous avons egalement mis en evidence une difference d'expressivite de la mutation lorsque le choc thermique a lieu aux stades 15 et 16. La determination de la position plus ou moins anterieure des cloques d'ascite, responsable d'une croissance normale ou anormale de la queue, varie suivant les individus entre le stade 15 et le stade 18 de la neurulation. Cependant, dans les experiences complementaires, e'est-a-dire pour les changements de 23 a 12 °C, la periode thermosensible semble plus allongee et se situer entre les stades 15 et 21. Insistons sur le fait que Panomalie de la queue s'exprime dans les conditions naturelles, et que pour ce caractere la 16-2

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temperature elevee a un effet curatif. On peut des lors concevoir que la guerison des germes soit un phenomene plus lent a obtenir. En ce qui concerne les troubles physiologiques, aboutissant notamment a l'accumulation de liquide dans la region cardiaque et dans 1'abdomen, nous avons montre que ces derniers surviennent quand les embryons sont soumis a la temperature la plus elevee jusqu'aux stades 24 ou 26. Ainsi, avant meme que l'organogenese ne soit achevee, sont realisees les conditions determinant des perturbations de la physiologie ulterieure de l'animal, meme si celui-ci vit desormais a temperature basse. L'ensemble des resultats obtenus nous permet, en outre, de supposer que la temperature la plus basse a une action preponderate precoce, non seulement sur la morphologie de la queue, mais aussi sur la morphologie cephalique. En effet, si la chaleur parait n'avoir aucune action correctrice sur le futur phenotype caudal a partir du stade 18 (voir 12°—st. 18 a st. 26-^23°), il semble par contre que le froid puisse encore modifier le phenotype ulterieur de certains mutants au stade 20 (voir 23°—st. 20->12°). De meme, si les futures anomalies 1, 5 et 6 (microcephalie, ascite cardiaque et ascite abdominale) ne sont plus accentuees par la chaleur apres le stade 26 (voir 12°—st. 26-^23°, le pourcentage de larves presentant ces anomalies est analogue a celui du groupe-temoin a 12°), le froid semble encore avoir une action benefique apres ce stade: la frequence des larves manifestant les anomalies citees est inferieure a celle du groupe-temoin maintenu a 23 °C (voir 23°—st. 26->12°). Au contraire, la temperature la plus elevee (23 °C) semble avoir un role plus important que celui de la temperature la plus basse, en ce qui concerne les anomalies circulatoires. Nous avons vu en effet (23°—st. 26->12°) qu'apres le stade 26, le froid ne peut plus empecher la future anemie de se manifester; la chaleur semble, par contre, avoir une action nocive apres ce stade (se referer au groupe 12°—st. 26->23°, ou la frequence des individus totalement anemiques est le double de celle observee chez le groupe-temoin eleve a 12 °C).

(C) Experiences de double changement de la temperature d'elevage (1) Changements de 12 a 23 °C et a 12 °C Ces resultats sont resumes dans le Tableau 6. (a) Premiere experience: 12°—st. 20^23°—st. 24-*12° Les larves observees presentent le plus souvent une morphologie cephalique normale, leurs branchies ne sont que tres rarement atrophiees (3 %) et sont meme normales ou subnormales chez 40 % d'entre elles. Generalement l'ascite ne perturbe pas la morphologie des animaux car, lorsqu'elle est presente dans la region cardiaque et l'abdomen (15 % des cas), l'accumulation de liquide y est faible. Quant au phenotype de la queue, il est normal pour la quasi-totalite

12°—st. 12°—st. 12°—St. 12°—st.

20 21 22 23

-> 23°—st. ^23°—st. ^23°—st. ->23°—st.

24 26 26 26

Type d'experience

^12° ^12° ^12° -> 12°

85 100 342 61

Nombre de larves observees 13,0+ 7,3 21,0± 8,1 23,7± 4,6 38,0±12,4

24,0± 9,3, 66,0± 9,5 59,3 ± 5,3 46,0±12,8

19,0± 8,5 81,0± 7,8 66,0± 5,1 75,0±ll,l

Absence d'erythrocytes Microcephalie branchiaux Ascite caudale (2) (1) 2,0±3 ll,0±6,3 9,6±3,3 16,0±9,4

Croissance anormale de la queue {4)

J5,0± 7,7 38,0± 9,7 32,2± 5,1 48,0±12,8

Ascite cardiaque

Moyenne des pourcentages observes pour les differents caracteres ± 212° II est interessant de constater que la proportion de larves totalement anemiques, chez lesquelles aucun erythrocyte ne circule dans les branchies, est semblable a celle relevee pour le groupe 12°—st. 22->23°. Tout se passe done comme si le retour a 12 °C n'avait pas eu lieu ou, en d'autres termes, comme si le froid n'exercait aucune action correctrice vis-a-vis de cette anomalie apres le stade 26. Ceci est tout-a-fait en accord avec ce que nous avons remarque precedemment pour les experiences ne faisant intervenir qu'un seul choc thermique. Les cloques presentes dans la nageoire sont de petite taille et les anomalies caudales sont moins frequentes que chez les temoins les moins anormaux (9,6 % contre 18,4 % chez le groupe-temoin eleve a 23 °C). (d) Quatrieme experience: 12°—st. 23-^23°—st. 26->12° La frequence des larves anemiques (46 %) est significativement plus faible que celle de la serie 12°—st. 21-»23°—st. 26^12° (66 %), ou le sejour a 23 °C commencait plus tot (e = 2,5). II faut remarquer, ici encore, que la morphologie caudale n'a pas ete affectee par le sejour initial a 12 °C. C'est pourquoi le resultat obtenu (16 % de larves a queue anormale) est paradoxal compare a celui du groupe 12°—st. 23->23° ou 79,2 % des individus presentaient l'anomalie.


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(2) Changements de 23 a 12 °C et a 23 °C Quatre experiences de ce type ont ete realisees: le transfert de 23 a 12 °C a ete effectue au stade 19, 20, 21 ou 22 selon la serie, mais le deuxieme choc thermique a toujours eu lieu au stade 26. Les resultats obtenus sont plus homogenes que ceux des experiences precedentes, bien que le nombre de larves observees dans chaque serie soit peu eleve. Nous avons constate que, quelle que soit la duree du sejour a 12 °C, les animaux observes au stade de la prise de nourriture, se presentent globalement comme s'ils avaient constamment evolue a 18 °C, ce qui exprime Faction temporaire du froid sur un developpement se deroulant dans l'enserable a 23 °C. Ainsi un sejour a 12 °C entre les stades 19 et 26 suffit pour accroitre considerablement le pourcentage d'anomalies de la croissance caudale par rapport au groupe-temoin eleve a 23 °C. La frequence des individus a queue recourbee (50 % des cas environ) est egalement superieure a celles observees chez des embryons qui subissent uniquement le premier choc thermique (voir les resultats des groupes 23°—st. 19 a 22-^12°, Tableau 4). Tout se passe done comme si le ret our a 23 °C au stade 26 renforcait les effets du froid au lieu de les attenuer. Mentionnons d'autre part que le pourcentage d'animaux presentant les anomalies 5 et 6 est superieur a celui que Ton obtient quand le deuxieme changement de la temperature n'intervient pas. L'ascite cardiaque et abdominale est toutefois moins frequente que chez les germes eleves en permanence a 23 °C. Le sejour a 12 °C presente done a cet egard une action preventive sur un certain nombre d'individus. L'anemie est egalement moins frequente que dans le groupe-temoin eleve a 23 °C, mais elle reste signincativement plus elevee que dans les groupes 23°—st. 19 a 22^12°. ]ci encore, les premiers stades posterieurs a la neurulation semblent done thermosensibles, ce qui rejoint les observations faites a l'occasion des doubles changements 12° ^23° ^12°. (3) Discussion Lorsque nous avons entrepris les experiences de double changement de la temperature d'elevage, notre but etait de savoir si chaque choc a des effets independants (ou non) de celui qui le suit ou qui l'a precede. Pour essayer d'elucider ce probleme, nous nous sommes bases sur les resultats des experiences faisant intervenir un seul choc thermique, et avons choisi les stades de changement en consequence. Rappelons que la periode thermosensible pour la morphologie caudale se situe pendant la neurulation, entre les stades 15 et 18 (cf. experiences 12°->23°) ou 15 et 21 (cf. 23° -^12°) selon le type de traitement; en ce qui concerne le fonctionnement physiologique global apprecie par la presence d'ascite, la periode comprise entre les stades 24 et 26 s'avere egalement critique.

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Ainsi, le premier choc thermique devait nous permettre de verifier si la position de la cloque d'ascite etait reellement determined, et le deuxieme, si la determination de l'apparition de l'ascite cardiaque et abdominale etait definitive. L'interpretation des resultats a ete faite par comparaison avec les groupestemoins et avec les experiences faisant intervenir un seul changement de la temperature d'elevage a un stade correspondant. (a) Morphologie caudale. Pour les changements 12°->23O-^12°, le premier choc a toujours eu lieu a un stade posterieur a la periode sensible precedemment mise en evidence. Des lors, nous nous attendions a trouver un phenotype caudal correspondant au premier choc thermique, comme pour les groupes 12°—st. 20 a 23->23°. Les resultats obtenus sont tout-a-fait differents. Dans tous les cas, le traitement initial a 12 °C ne parait avoir eu aucun effet sur la morphologie ulterieure. La croissance caudale est en realite beaucoup moins anormale; la chaleur exerce done un effet curatif. Ainsi, les mutants de la premiere serie (Tableau 6) reagissent comme ceux du groupe 23°—st. 24-^12° (second choc thermique), et pour les germes ac/ac des deuxieme, troisieme et quatrieme series, tout se passe meme comme si leur developpement s'etait deroule constamment a 23 °C. Pour les changements 23°-^12°->23°, les phenotypes de la queue correspondent a ceux que Ton observe lorsque les individus evoluent constamment a 18 °C. Ici encore, les resultats semblent contradictoires avec ceux des groupes 23°->12° aux stades correspondants (premier choc thermique), comme nous l'avons dit precedemment. Si on effectue un seul changement de temperature, les effets de la deuxieme temperature paraissent nuls apres un certain stade, que nous pouvons fixer approximativement autour du stade 20. Mais si on revient a la temperature initiale vers les stades 24-26, tout se passe comme si ce deuxieme traitement annulait les effets du premier. On constate alors que, pour des germes se developpant a 12 °C puis a 23 °C, le retour au froid permet aux effets de la chaleur de se manifester et meme de se renforcer. Inversement, pour des germes qui se developpent a 23 °C puis a 12 °C, le retour a 23 °C permet aux effets du froid de se manifester. Rappelons que les effets respectifs du froid et de la chaleur sont definis par le phenotype caudal largement dominant soit chez les temoins maintenus constamment a 12 °C, soit chez ceux eleves en permanence a 23 °C. Cet ensemble de resultats nous permet seulement de supposer que si la determination de la position de la cloque d'ascite dans la nageoire est stabilised a un stade precoce (en fonction de la temperature d'elevage initiale), elle n'est pas pour autant irreversible, jusqu'a un stade un peu plus avance ou le bourgeon caudal est deja nettement forme. Cependant, cette constatation ne nous permet pas de comprendre pourquoi, lorsque nous effectuons un changement de la temperature d'elevage de 23 a 12 °C au stade 26, stade ou le phenomene est le plus frappant, la frequence des larves a queue normale (99,1 %) est tres superieure a celle que Ton observe


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chez les temoins eleves a 23 °C (81,6 %). On retrouve ici un phenomene paradoxal: le passage au froid regularise mieux la croissance caudale que ne peut le faire la chaleur seule, alors que, agissant plus tot ou exclusivement, le froid entraine au contraire des effets diametralement opposes. Cette action s'exerce evidemment en premier lieu sur l'accumulation d'ascite dans l'epiderme caudal, mais ce phenomene physiologique obeit manifestement a un determinisme d'allure assez deroutante. Nous pouvons comparer une telle complexite a celle qui parait presider au determinisme de la differentiation des gonades chez les Drosophiles triploides intersexuees, etudiees par Lauge (1969). Des traitements a 30 °C pendant 24 h provoquent une feminisation des gonades lorsqu'ils sont appliques au moment de la vie embryonnaire et, pour l'une des deux souches utilisees (la souche principale) egalement a la fin de la vie pupale. L'auteur n'avance pas d'hypothese permettant d'interpreter l'augmentation de la frequence des individus a ovaires au cours de la phase pupale, puisque 'la determination des gonades semble tres tot definitive (premieres divisions nucleaires)'. Ici aussi une determination precoce semble sujette a des exceptions. (b) Ascite caudale. Elle est le caractere le plus specifique de la mutation, et nous venons de voir que son accumulation obeit a un determinisme tres complexe. Nous avons note qu'il n'existe pas de rapport etroit entre l'aspect de la queue et l'importance quantitative des cloques; c'est la position de ces dernieres qui semble avoir le role le plus important et qui est modifiee par la temperature. Nous avons cependant remarque que le caractere est presque inexistant chez les 19 % de larves qui en sont atteintes dans la serie 12°—st. 20->23°—st. 24-^12°, de meme que chez les 17 % de larves du groupe 23°—st. 26->12°. La physiologie des mutants semble done pouvoir subir des effets correcteurs pousses de la part des changements de temperature. (c) Microcephalie, anemie, ascite cardiaque et ascite abdominale. Ces caracteres s'averent n'etre que des consequences secondaires de la mutation. On observe d'ailleurs de tels syndromes chez les mutants r\r et eje d'Axolotl (Humphrey, 1964, 1972). La frequence des larves totalement anemiques augmente lorsque la duree du sejour a 23 °C apres la neurulation s'accroit. La difference observee est en effet significative si Ton compare les resultats des series 12°—st. 23^23°—st. 26^12° (46 %) et

12°—st. 21 -^23°—st. 26^12° (66 %)

11 en est de meme dans les experiences complementaires: 23°—st. 19^12°—st. 26^23° (45 %) et

23°—st. 22^12°—st. 26-^23° (62 %).

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Ces observations sont egalement valables pour les anomalies cephaliques. En ce qui concerne l'ascite cardiaque et abdominale, les frequences obtenues lors des experiences 23° ->12°->-23° sont superieures a celle des groupes 23°—st. 19 a 22->12° et 12°—st. 26^23° mais inferieures a celle des temoins a 23 °C. Le sejour a temperature basse entre les stades 19 et 26 diminue done la gravite de l'ascite ulterieure. Correlativement, les pourcentages de ces anomalies dans les experiences complementaires 12° -^23° -^12° sont inferieurs a ceux que Ton observe pour les groupes 12°—st. 20 a 23^23° et 23°—st. 24 ou 26->12°, mais superieurs a ceux des temoins maintenus constamment a 12 °C, sauf pour la premiere serie. La chaleur joue done un role entre les stades 20 et 26 en favorisant l'apparition ulterieure d'ascite. Ainsi, la conclusion que nous avons tiree apres les experiences 23°->12° et 12° ->23° se trouve done precisee. II faut souligner que les resultats de la serie 12°—st. 20^23°—st. 24->12° sont particulierement interessants, car les caracteristiques essentielles de la mutation ont disparu chez la majorite des larves. Des lors, l'idee d'une guerison possible des germes par un traitement thermique approprie (par exemple 12°—st. 18->23°—st. 24->12°) n'est pas a ecarter. DISCUSSION GENERALE ET CONCLUSION

Le phenotype des mutants ac/ac varie selon le type de traitement thermique qu'ils ont subi et le stade de developpement auquel il est applique. Dans un premier temps, nous avons montre qu'il existe des phases thermosensibles entrainant des modifications du phenotype, grace aux experiences faisant intervenir un seul changement de la temperature d'elevage, de 12 a 23 °C ou de 23 a 12 °C. La periode au cours de laquelle il est possible de determiner la morphologie ulterieure de la queue correspond a une grande partie de la neurulation (stades 1 5 a l 8 o u l 5 a 2 1 selon la temperature appliquee). Quand les germes sont soumis au changement de temperature apres la neurulation, ils presentent aux stades 37-38 un phenotype caudal correspondant a celui qu'on observerait si on avait maintenu les embryons a la premiere temperature d'elevage pendant toute la duree de leur developpement. La frequence des larves a queue rectiligne dans le groupe transfere de 23 a 12 °C au stade 26, est meme tres superieure a celle qu'on trouve pour les mutants temoins eleves constamment a 23 °C: ce phenomene apparait comme assez paradoxal, la temperature la plus basse ayant un effet inverse lorsqu'elle agit seule pendant tout le developpement. La localisation ou l'absence finales de la cloque d'ascite dans la nageoire caudale, responsables de la morphologie observee, semblent done definitivement determinees pendant la phase terminale de la neurulation. L'accumulation ou l'absence d'accumulation de liquide ascitique dans la cavite pericardique et


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l'abdomen paraissent de meme etre soumises a un determinisme precoce, bien que plus tardif que le precedent, et ne pas dependre de la temperature a laquelle vit 1'embryon aux stades ou le fonctionnement des appareils circulatoire et excreteur est pleinement assure. Mais, dans un deuxieme temps, les resultats des experiences de double changement de temperature, qui avaient pour but d'eprouver l'independance des effets des deux chocs thermiques, ont dementi en partie ces conclusions. Nous sommes des lors amenes a penser que, si la determination precoce de la position de la cloque d'ascite est stable dans des conditions de temperature donnees, elle n'est pas pour autant irreversible. On observe ici des effets qu'on peut qualifier de paradoxaux, en attendant de leur trouver une explication satisfaisante. Si la methode des chocs thermiques appliques a des mutants thermosensibles 'permet de provoquer ou d'enrayer a volonte les effets de genes lethaux et de dresser eventuellement la chronologie de leurs periodes d'action et de leurs consequences sur le developpement', chez les microorganismes et la Drosophile (Fraser, 1970), les problemes poses semblent done moins faciles a resoudre quand on considere une mutation thermosensible semi-lethale chez un Vertebre. La determination embryonnaire, quand elle implique des processus d'ordre essentiellement physiologique, apparait comme tres complexe. II reste en tout cas acquis que l'expression de diverses anomalies physiologiques chez les mutants acjac, a un stade avance du developpement, se trouve sous la dependance de phenomenes qui se deroulent beaucoup plus tot chez 1'embryon et qu'on peut influencer de maniere durable en modifiant la temperature a laquelle se developpe celui-ci pendant une phase donnee. Les effets anemiants d'une temperature elevee agissant aux premiers stades qui suivent la neurulation, e'est-a-dire lors de la formation de l'ilot sanguin, pourront en particulier faciliter l'etude experimental des manifestations de ce caractere. Des recherches anterieures ont deja montre que cette anemie est transmissible par parabiose a des embryons normaux, soit de la meme espece, soit d'Axolotl, et qu'un facteur diffusible anti-erythrocytaire existe probablement chez les embryons mutants (Jaylet, Beetschen & Deparis, 1970; Fernandez & Beetschen, 1973). RESUME 1. Chez le Pleurodele, un fort pourcentage (79 %) de larves homozygotes acjac presenters au stade 38 (prise de nourriture) une queue recourbee par suite de la presence d'une cloque d'ascite dans la region dorsale de la nageoire, quand le developpement embryonnaire s'est deroule a 12°C; 25% environ d'entre elles sont affectees par de l'ascite abdominale et pericardique et environ 40 % peuvent se nourrir et survivre. Le phenotype larvaire est tres different quand le developpement s'est effectue a 23 °C; dans ce cas, la croissance de la queue est normale, mais 95 % des larves sont lethales, en raison de l'accumulation de liquide ascitique dans la cavite abdominale et la region cardiaque, d'une forte anemie et de microcephalie. 2. L'echange de la plaque neurale posterieure et de l'epiderme dorso-lateral entre des

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neurulas normales et mutantes a montre que la localisation de la cloque dans la nageoire dorsale n'est pas la consequence de proprietes intrinseques des tissus mutants dorsaux, mais doit etre considered comme le resultat de troubles physiologiques generaux affectant l'organisme des mutants. 3. On a effectue des experiences impliquant l'intervention d'un changement de temperature, de 12 a 23 °C ou de 23 a 12 °C, a divers stades du developpement, de la fin de la gastrulation (st. 13) a l'apparition des contractions musculaires spontanees (st. 26). Quand le changement intervient apres la fin de la neurulation (st. 21), le phenotype caudal est statistiquement semblable a celui de larves qui avaient ete elevees en permanence a la premiere temperature utilisee. On a pu ainsi caracteriser des phases thermosensibles, entre les stades 15 et 18 de la neurula (pour un passage de 12 a 23 °C) ou entre les stades 15 et 21 (pour un passage de 23 a 12°C). De meme, on peut induire l'apparition d'ascite abdominale quand on maintient les embryons a 23°C jusqu'au stade 23 seulement (jeune bourgeon caudal); cette ascite survient au contraire beaucoup moins frequemment quand on maintient les embryons a 12°C jusqu'au stade 23 avant de les transferer a 23 °C. 4. On a pu conclure de ces experiences que le phenotype caudal des mutants est deja determine par la temperature pendant la neurulation, avant le stade 21. Neanmoins, des experiences de double changement de la temperature d'elevage ont demontre que le deuxieme changement modifie les resultats que Ton devrait obtenir si le premier changement seulement avait ete effectue. On a ainsi obtenu des resultats paradoxaux, plus de 90 % des phenotypes caudaux etant du type 'chaud' quand les embryons avaient d'abord ete maintenus a 12°C, puis a 23 °C entre les stades 22 et 26, puis de nouveau a 12°C. Un tel traitement abaisse fortement le pourcentage de queues recourbees ('type froid') qui devrait etre obtenu si les embryons acjac etaient maintenus en permanence a 23 °C apres le stade 21, ce traitement plus long par la chaleur restant lui-meme sans effet par comparaison avec les resultats obtenus quand le developpement se deroule entierement a 12°C (queues recourbees predominates dans ce dernier cas). Done, si on peut considerer que la determination precoce de la position de la cloque caudale est un phenomene stable dans des conditions donnees de temperature, elle n'est pas pour autant irreversible. 5. Par comparaison avec les larves elevees au froid, on a obtenu trois fois plus de larves ac/ac completement anemiques (66 %) a partir d'embryons maintenus a 23 °C entre les stades 21 et 26, ce qui offre un moyen d'etude experimentale de cette anemie. 6. On suggere diverses implications de ces resultats pour l'analyse ulterieure de mutations thermosensibles chez les Vertebres poiikilothermes. Nous remercions vivement M. Le Professeur L. Bonnet, du Laboratoire de Biologie quantitative de l'Universite Paul Sabatier, pour les conseils qu'il nous a aimablement fournis dans le choix des methodes statistiques utilisees. TRAVAUX CITES J. C. (1970). Existence d'un effet maternel dans la descendance des femelles de l'Amphibien Urodele Pleurodeles waltlii homozygotes pour le facteur ac (ascite caudale). C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 270, 855-858. BEETSCHEN, J. C. (1971). Thermosensibilite de la mutation 'ascite caudale' chez Pleurodeles waltlii (Amphibien Urodele). C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 273, 97-100. BEETSCHEN, J. C. & JAYLET, A. (1965). Sur un facteur recessif semi-lethal determinant l'apparition d'ascite caudale (ac) chez le Triton Pleurodeles waltlii. C. r. hebd. Seanc. Acad. Sci., Paris 261, 5675-5678. BODENSTEIN, D. (1952). Studies on the development of the dorsal fin in Amphibia. /. exp. Zool 120, 213-245. BRIGGS, R. (1972). Further studies on the maternal effect of the o gene in the Mexican Axolotl. /. exp. Zool. 181, 271-280. BRIGGS, R. (1973). Developmental genetics of the Axolotl. In Genetic Mechanisms of Development (ed. F. H. Ruddle), pp. 169-199. New York, London: Academic Press. BEETSCHEN,


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{Received 4 February 1975, revised 13 March 1975)