Supplementary data Supplementary Material and

0 downloads 0 Views 9MB Size Report
Supplementary data. Supplementary Material and Methods. Cloning. The coding sequences of eIF2B subunits α, β and δ were amplified by PCR as individual ...
Supplementary data  Supplementary Material and Methods  Cloning  The  coding  sequences  of  eIF2B  subunits  α,  β  and  δ  were  amplified  by  PCR  as  individual  exons  from  Chaetomium  thermophilum  genomic  DNA  and  introduced  into  the  expression  vector  according  to  the  InFusion protocol (Clontech). The coding sequence for full‐length eIF2Bα was introduced into a modified  pET15b vector cleaved with the restriction enzymes NcoI and XhoI. The coding sequences for full‐length  cteIF2Bβ and ‐δ were introduced into the pGEX‐6P1 vector cleaved with BamHI and XhoI.   The  constructs  encoding  cteIF2BβΔ123‐148  and  cteIF2Bδ130‐C  were  generated  by  deletion  of  the  corresponding coding regions from the original plasmids (wild‐type eIF2Bβ and eIF2Bδ in pGEX‐6P1). The  deletion constructs as well as site‐directed mutagenesis to generate point mutants of cteIF2Bα, ‐β or ‐δ  were performed according to the QickChange protocol (Stratagene).     Protein expression and purification  Expression:  All  constructs  were  expressed  in  E.  coli  BL21(DE3)  Rosetta  II  cells  (Novagene).  Cells  containing the respective plasmids were grown in 2xYT medium (supplemented with antibiotics) at 37 °C  with  shaking  at  220  rpm  until  they  reached  an  OD600  of  ‫׽‬0.8.  Subsequently  the  cell  cultures  were  transferred  to  16  °C  and  the  expression  was  induced  by  the  addition  of  isopropyl‐β‐D‐ thiogalactopyranosid (IPTG) to a final concentration of 0.5 mM. The cells were harvested after 16 hours  at 16 °C.  Purification  of  eIF2Bα:  Cells  containing  N‐terminally  His‐tagged  eIF2Bα  (wild‐type  and  mutants)  were  resuspended in L‐100‐His buffer (20 mM Hepes (pH 7.5), 100 mM KCl, 10% glycerol, 15 mM imidazole, 2  mM  β‐mercaptoethanol)  containing  a  mixture  of  protease  inhibitors.  Cell  lysis  was  performed  in  a  microfluidizer (Microfluidics, USA), and cell debris was removed by centrifugation for 30 min at 30,000  xg. The supernatant was loaded onto a HisTrap column (GE Healthcare) equilibrated in L‐100‐His buffer.  The column was then washed with 2 column volumes of L‐100‐His buffer and bound protein was eluted  with a linear gradient into elution buffer (L‐100‐His buffer with 350 mM imidazole). Fractions containing  the  target  protein  were  desalted  in  L‐100‐His  buffer  on  a  HiPrep  Desalting  column  (GE  Healthcare),  before adding TEV protease in a 1:100 weight ratio of protease to target protein to remove the His‐tag.  The cleaved protein was separated from the His‐tag and uncleaved protein by a second HisTrap run. The  flow‐through was finally concentrated to a volume of 5 ml and applied to a Superdex S‐200 gelfiltration  column (GE Healthcare) equilibrated in G‐100 buffer (10 mM Hepes (pH 7.5), 100 mM KCl, 10% glycerol 

1   

and 2 mM DTT). The protein was concentrated to ~20 mg/ml, flash‐frozen in liquid nitrogen and stored  at ‐80 °C.  Purification of eIF2Bβ and eIF2Bδ: All constructs (wild‐type and mutants) were expressed as N‐terminally  GST‐tagged fusion proteins. Cell lysis was performed as described for eIF2Bα with the difference that L‐ 500 buffer (20 mM Hepes (pH 7.5), 500 mM KCl, 10% glycerol, 4 mM β‐mercaptoethanol) was used to  resuspend  the  cells.  After  removal  of  cell  debris  by  centrifugation,  the  supernatant  was  applied  to  a  GSTrap  column  (GE  Healthcare)  equilibrated  in  L‐500  buffer.  After  washing  the  column  with  4  column  volumes  of  L‐500  buffer,  bound  protein  was  eluted  with  30  mM  reduced  glutathione  in  L‐500  buffer.  Fractions  containing  the  target  protein  were  pooled  and  desalted  on  a  HiPrep  Desalting  column  equilibrated  in  desalting  buffer  (10  mM  Hepes  (pH  7.5),  200  mM  KCl,  10%  glycerol,  4  mM  β‐ mercaptoethanol). The pooled protein was incubated over night at 4 °C with Prescission protease in a  1:100  weight  ratio  of  protease  to  target  protein  to  remove  the  GST‐tag.  In  order  to  remove  the  GST‐ tagged protease, cleaved GST and uncleaved fusion protein the sample was applied to a second GSTrap  column equilibrated in desalting buffer. The flow‐through was pooled and concentrated to 5 ml before  loading onto a Superdex S‐200 gelfiltration column equilibrated in G‐100 buffer. eIF2Bβ, eIF2Bβ∆123‐148,  and eIF2BβA286E which eluted as pure protein in a single peak, were concentrated to 15‐20 mg/ml and  stored at ‐80 °C. eIF2Bδ usually suffered strong degradation resulting in the cleavage of some of the full‐ length  protein  into  two  fragments  migrating  at  ‫׽‬37  kDa  and  ‫׽‬20  kDa  according  to  SDS‐PAGE.  As  a  consequence, eIF2Bδ eluted in two major peaks from the S‐200 column containing either the full‐length  protein or the 37‐kDa fragment. According to MS analysis, the 37‐kDa fragment contained residues 128‐ 466 of eIF2Bδ. Full‐length eIF2Bδ and the 37‐kDa fragment were pooled separately, concentrated to 10‐ 15 mg/ml and stored at ‐80 °C. Deletion constructs and point mutations of eIF2Bβ and ‐δ were purified  according to the same protocol.    Protein crystallization and structure determination  eIF2Bβ. Initial crystallization trials for full‐length eIF2Bβ were performed by sitting‐drop vapor diffusion  with  commercially  available  standard  screens.  No  crystals  were  obtained  at  any  of  the  tested  protein  concentrations  (between  6  and  15  mg/ml)  or  temperatures  (4  and  20  °C).  In  order  to  improve  the  crystallizability  of  the  protein,  we  decided  to  remove  residues  123  to  148  by  deletion  of  the  corresponding coding sequence in the expression vector. According to multiple sequence alignments of  C.  thermophilum  eIF2Bβ  with  its  homologs  from  other  species,  these  residues  are  not  conserved  and  seem to correspond to an extended loop region between two conserved α‐helices that is idiosyncratic to  2   

cteIF2Bβ (Figure S1). Thus, we reasoned that its removal would have no negative impact on the overall  structure of the protein, which is supported by the fact that it still forms a complex with eIF2B subunits  α  and  δ.  In  initial  crystallization  trials  with  the  construct  eIF2BβΔ123‐148,  crystals  were  obtained  after  5  days  at  20  °C  in  a  condition  containing  100  mM  HEPES  (pH  7.5)  and  1.0  M  tri‐sodium  citrate.  After  optimization,  diffraction  quality  crystals  were  obtained  with  9.5  mg/ml  protein  at  20  °C  in  100  mM  HEPES  (pH  6.8)  and  1.33  M  tri‐sodium  citrate.  X‐ray  diffraction  data  were  collected  at  BL  14.1  (HZB,  BESSY, Berlin) (1). The phase problem was solved by molecular replacement using the program PHASER  (2)  and  the  atomic  coordinates  of  the  N‐terminal  domain  of  the  Bacillus  subtilis  5‐methylthioribose  1‐ phosphate  isomerase  (PDB:  2YVK)  and  the  C‐terminal  domain  of  Homo  sapiens  eIF2Bα  (PDB:  3ECS)  as  independent search models. The structure was refined in trigonal space group R3 at a resolution of 2.54  Å using the program PHENIX (3). Missing regions of the peptide chain were built manually in Coot (4).  The final model contains two molecules per asymmetric unit (see Table 1 for details of data collection  and refinement).      eIF2Bδ.  Initial  crystallization  trials  for  eIF2Bδ  were  performed  by  sitting‐drop  vapor  diffusion  with  commercially available standard screens. With the truncated version of eIF2Bδ (36 kDa fragment) initial  crystals grew with 10 and 12 mg/ml protein at 20 °C in a condition containing 100 mM MES (pH 6.0) and  1.0 M (NH4)2SO4. After optimization, diffraction quality crystals were obtained in 100 mM MES (pH 6.2)  and 0.8 M (NH4)2SO4. X‐ray diffraction data were collected at BL 14.1 (HZB, BESSY, Berlin) (1). The phase  problem  was  solved  by  molecular  replacement  using  PHASER  (2).  As  search  models  the  atomic  coordinates  of α‐helices  2‐4 (residues 27‐93) of the N‐terminal  domain of Homo sapiens  eIF2Bα (PDB:  3ECS), and residues 116‐295 of its C‐terminal domain were used. The structure was refined in primitive  orthorhombic  space  group  P212121  at  a  resolution  of  2.55  Å  using  the  program  PHENIX  (3).  The  final  model  contains  two  molecules  per  asymmetric  unit  (see  Table  1  for  details  of  data  collection  and  refinement).                          3   

Supporting Figures 

  Figure S1. Multiple sequence alignment of eIF2Bβ orthologs. Highly conserved residues are highlighted  in  dark  blue,  conserved  residues  in  light  blue  and  variable  residues  in  gray;  the  numbering  above  the  alignment corresponds to the C. thermophilum ortholog (cteIF2Bβ). Residues that were removed in the  crystallized  cteIF2BβΔ123‐148  construct  are  highlighted  in  red.  Helices  α5  and  α6  with  the  kink  region  as  4   

well  as  the  C‐terminal  helix  α12  are  indicated  as  magenta  cylinders.  Surface  exposed  Gcd‐  and  Gcn‐  mutations  are  indicated  with  S.  cerevisiae  numbering  below  the  alignment  in  orange  and  pink,  respectively;  exposed  VWM/CACH  mutations  are  indicated  with  H.  sapiens  numbering  in  green;  the  corresponding C. thermophilum numbers are given in brackets. Mutations of cteIF2Bβ used in this study  are indicated by diamonds and the introduced amino‐acid above the alignment. Species abbreviations:  ct  –  Chaetomium  thermophilum;  sc  –  Saccharomyces  cerevisiae;  os  ‐  Oryza  sativa;  sp  –  Schizzosaccharomyces pombe; dd – Dictyostelium dyscoideum; tr ‐ Takifugu rubripes; gg – Gallus gallus;  oc  –  Oryctolagus  cuniculus;  hs  –  Homo  sapiens;  bt  –  Bos  taurus;  mm  –  Mus  musculus;  rn  –  Rattus  norvegicus.     

5   

  Figure S2. Multiple sequence alignment of eIF2Bδ orthologs. Highly conserved residues are highlighted  in  dark  blue,  conserved  residues  in  light  blue  and  variable  residues  in  gray;  the  numbering  above  the  alignment corresponds to the C. thermophilum ortholog (cteIF2Bδ). The poorly conserved N‐terminal tail  which is absent from the crystal structures is not included in the alignment; the black arrow marks the  first  residue  defined  in  the  isolated  crystal  structure,  the  red  arrow  marks  the  first  residue  defined  in  cteIF2Bδ of the eIF2B(βδ)2 complex structure. Helices α5 and α6 with the kink region as well as the C‐ terminal helix α12 are indicated as magenta cylinders. For helix α12 the secondary structure prediction,  as calculated by the Psipred server (http://bioinf.cs.ucl.ac.uk/psipred/), is shown behind the alignment.  Surface  exposed  Gcd‐  and  Gcn‐  mutations  are  indicated  with  S.  cerevisiae  numbering  below  the  alignment  in  orange  and  pink,  respectively;  exposed  VWM/CACH  mutations  are  indicated  with  H.  6   

sapiens  numbering  in  green;  the  corresponding  C.  thermophilum  numbers  are  given  in  brackets.  Mutations  of  cteIF2Bδ  used  in  this  study  are  indicated  by  diamonds  and  the  introduced  amino‐acid  above  the  alignment.  Species  abbreviations:  ct  –  Chaetomium  thermophilum;  sc  –  Saccharomyces  cerevisiae;  sp  –  Schizzosaccharomyces  pombe;  dd  –  Dictyostelium  dyscoideum;  oc  –  Oryctolagus  cuniculus; hs – Homo sapiens; bt – Bos taurus; mm – Mus musculus; rn – Rattus norvegicus.         

7   

    Figure S3. Multiple sequence alignment of eIF2Bα orthologs. Highly conserved residues are highlighted  in  dark  blue,  conserved  residues  in  light  blue  and  variable  residues  in  gray;  the  numbering  above  the  alignment corresponds to the H. sapiens ortholog (hseIF2Bα). Helices α5 and α6 with the kink region, as  well  as  the  C‐terminal  helix  α12  are  indicated  as  magenta  cylinders.  Surface  exposed  Gcd‐  and  Gcn‐  mutations  are  indicated  with  S.  cerevisiae  numbering  below  the  alignment  in  orange  and  pink;  the  corresponding H. sapiens numbers are given in brackets. Exposed VWM/CACH mutations are indicated  with H. sapiens numbering in green. Mutations of cteIF2Bα used in this study are indicated by diamonds  8   

and  the  introduced  amino‐acid  above  the  alignment.  Species  abbreviations:  hs  –  Homo  sapiens;  sc  –  Saccharomyces  cerevisiae;  ct  –  Chaetomium  thermophilum;  sp  –  Schizzosaccharomyces  pombe;  ce  –  Caenorhabditis elegans; dd – Dictyostelium dyscoideum; dm – Drosophila melanogster; pa ‐ Pongo abelii;  mf – Macaca fascicularis; bt – Bos taurus; rn – Rattus norvegicus; mm – Mus musculus.                                               

9   

  Figure S4. SEC‐MALS and pull‐down analysis of interactions between eIF2Bα, eIF2Bβ and/or eIF2Bδ. A)  SEC  run  for  eIF2Bδ130‐C  lacking  the  poorly  conserved,  presumably  flexible  residues  1‐129.  The  protein  elutes  in  a  single  peak  at  15.1  ml  (compared  to  13.1  ml  for  full‐length  eIF2Bδ);  the  molar  mass  distribution as calculated by MALS, indicated by a black line inside the peak, yields a MW of 43.6 kDa in  good agreement with the expected mass of 37 kDa for the monomer. The peak eluting around 13.9 ml  corresponds  to  the  GST  dimer  (~52  kDa)  which  was  not  completely  removed  during  purification.  SDS‐ PAGE analysis of the peak fraction is shown as inset. B) SEC experiment with eIF2Bα and eIF2Bβ. The two  subunits elute as observed for the individual proteins (Figure 3A/B), with eIF2Bα eluting as a dimer at  13.1  ml  and  eIF2Bβ  eluting  as  a  monomer  at  14.8  ml.  No  complex  formation  is  observed.  C)  As  for  eIF2Bβ, no complex formation is observed between eIF2Bα and eIF2Bδ. Both proteins elute at virtually  identical  elution  volumes,  giving  rise  to  one  single  elution  peak  at  13.1  ml  as  expected  from  their  respective individual runs (Figure 3A/C). D) SEC‐MALS run for eIF2Bα with eIF2BβΔ123‐148 and eIF2Bδ. The  hexameric  complex  is  formed  despite  the  deletion  in  eIF2BβΔ123‐148.  The  molar  mass  distribution  as  calculated by MALS yields a MW of 251 kDa in good agreement with the mass of 256 kDa observed for  the wild‐type complex (Figure 3F). E) GST pull‐downs between eIF2Bα, ‐β, and ‐δ. Lanes 1 to 4 show the  isolated  proteins  as  reference  (in  lane  1  the  two  bands  directly  above  the  55  kDa  marker  are  GST‐ containing  degradation  products  of  GST‐eIF2Bδ).  Lanes  5  to  7  show  the  elution  fractions  (after  the  removal  of  unbound  proteins  by  extensive  washing)  for  the  pull‐down  experiments  of  GST‐tagged  eIF2Bδ with full‐length eIF2Bβ (Lane 5), with the deletion  construct  eIF2BβΔ123‐148 (6), and with eIF2Bα  alone  (7).  Both  eIF2Bβ  constructs  bind  stably  to  eIF2Bδ.  By  contrast,  as  for  the  shorter  eIF2Bδ130‐C  construct (Figure 5A, lane 10), full‐length eIF2Bδ does not form a stable complex with eIF2Bα. Lanes 8  and  9  show  the  elution  fractions  for  the  pull‐downs  of  GST‐tagged  eIF2Bδ  with  eIF2Bα  and  full‐length  eIF2Bβ  (Lane  8)  or  with  eIF2Bα  and  the  deletion  construct  eIF2BβΔ123‐148  (9).  In  both  cases,  a  stable  complex containing all three subunits is formed. 

10   

  Figure S5. Reconstruction of the model of the eIF2BRSC. A) Within the crystal structure of the eIF2B(βδ)2  complex,  the  dimer‐dimer  interface  is  formed  by  three  main  interfaces  (areas  I‐III).  Area  I  (orange  surface)  in  eIF2Bβ  associates  with  area  III  (cyan  surface)  in  eIF2Bδ  of  the  second  dimer,  while  area  II  11   

(light  brown)  of  eIF2Bβ  interacts  with  the  same  interface  in  eIF2Bβ  of  the  second  dimer  (indicated  by  arrows).  Residues  altered  by  Gcn‐  mutations  are  colored  in  pink.  B)  Association  of  the  two  canonical  eIF2Bβδ dimers as indicated in A results in the formation of the eIF2B(βδ)2 tetramer as observed in the  crystal structure (left), which provides a 2‐fold rotation symmetrical surface area for the likewise 2‐fold  rotation symmetrical surfaces of eIF2Bα2 (middle). The homologous (but non‐identical) binding surfaces  (areas I‐III) on the three subunits are colored as described in A. The right panel shows the top view onto  the  eIF2B(βδ)2  complex.  C)  Association  of  the  eIF2Bα2  dimer  to  eIF2B(βδ)2  results  in  the  eIF2Bα2(βδ)2  hexamer  (eIF2Bα2  is  rotated  relative  to  its  orientation  in  B  by  180°).  In  this  complex,  each  area  I  of  eIF2Bα2 is bound by area III of one of the two eIF2Bβ subunits, while areas II and III of eIF2Bα2 associate  with areas II and I of the two eIF2Bδ subunits, respectively. The right panel shows the top view onto the  eIF2Bα2(βδ)2  complex.  D)  Cartoon  presentation  of  a  tkRBPI  tetramer,  composed  of  two  canonical  homodimers. The orientation is the same as that of the eIF2B(βδ)2 complex in Figure 4A.      

12   

  Figure S6. Ligand Binding by cteIF2B regulatory subunits. A‐E) Thermal shift analysis of the effect of the  indicated  ligands  on  the  thermal  stability  of  cteIF2Bα  (A  &  B),  cteIF2BαS270Y  (C),  cteIF2Bβ  (D),  and  cteIF2Bδ (E). The normalized relative fluorescence is plotted against the temperature (in Kelvin). F) ITC  experiments  for  the  binding  of  various  ligands  by  wild‐type  cteIF2Bα.  cteIF2Bα  binds  tightly  to  GMP  (black squares) and AMP (red triangles) and moderately to ribose 5‐phosphate (R5P; purple circle) and  CMP  (blue  diamonds).  Although  phosphate  ions  (PO42‐;  green  circles)  and  glucose  6‐phosphate  (G6P)  show  a  weak  binding  signal,  thermodynamic  parameters  could  not  be  determined.  No  binding  signals  were  observed  for  the  other  ligands  including  ribulose  1,5‐bisphosphate  (RuBP),  dihydroxyacetone  phosphate (DHAP), NADP+, GDP and GTP. 

13   

Figure S7. A) Global conformational changes in the tkRBPI hexamer upon the transition from the open  apo  state  (top;  PDB  3A11)  to  the  closed  substrate‐bound  state  (bottom;  PDB  3VM6).  B)  Comparison  between the inter‐domain cavities in tkRBPI (PDB 3VM6), hseIF2Bα (PDB 3ECS), cteIF2Bβ, and cteIF2Bδ.  The  cavity  in  tkRBPI  is  shown  in  its  closed  state  with  the  substrate  ribose  1,5‐bisphosphate  (R15BP)  bound by the catalytic site residues (shown as balls and sticks in pink). In the structure of hseIF2Bα, a  sulfate  ion  occupies  the  position  of  the  5’  phosphate  of  R15BP  in  tkRBPI.  For  eIF2Bα,  ‐β,  and  ‐δ  Gcd‐  (orange sticks) and VWM/CACH mutations (green) are indicated with the numbering for the S. cerevisiae  and  human  orthologs,  respectively.  The  right  panel  shows  the  degree  of  evolutionary  conservation  of  residues in and around the cavity. 

14   

  Figure S8. Surface conservation and locations of Gcn‐, Gcd‐, and VWM/CACH mutations in the eIF2Bα2  homodimer.  A)  Cartoon  presentation  of  the  canonical  hseIF2Bα2  dimer  (PDB  3ECS)  with  the  two  monomers in light and dark gray. The upper panel shows the view on the backside of the dimer (facing  the two α12 helices); the lower panel shows the opposite frontal face with the cavity between N‐ and  CTD.  B)  Conservation  of  surface  residues  on  eIF2Bα.  The  highest  degree  of  sequence  conservation  is  found  on  the  backside  of  the  dimer  around  helix  α12  which  forms  the  proposed  interface  for  hexamerization (Figure 6A/C). With exception of the highly conserved inter‐domain cavity, the sequence  conservation is significantly lower on the front side which is not involved in interactions  with eIF2Bβδ  dimers or eIF2(α‐P) (see also Figure S7B). C) Positions of surface exposed Gcd‐ (orange) and VWM/CACH  mutations (green) in eIF2Bα2. Gcd‐ mutations are numbered according to the yeast eIF2Bα ortholog with  the corresponding residues of the human ortholog given in brackets. Y86 itself does not represent the  position of a Gcd‐ mutation but is preceded by a flexible loop not resolved in the crystal structure that  contains  the  Gcd‐  mutation  H82Y  (L81).  D)  Positions  of  Gcn‐  mutations  in  eIF2Bα2.  Numbers  in  pink  correspond to the yeast ortholog; black numbers in brackets give the corresponding residues in human  eIF2Bα. Orientations in B‐D are the same as in A.  15   

  ‐



Figure S9. Surface conservation and locations of Gcn , Gcd , and VWM/CACH mutations in the eIF2Bβδ  heterodimer.  A)  Cartoon  presentation  of  the  canonical  cteIF2Bβδ  heterodimer,  with  eIF2Bβ  in  yellow  and eIF2Bδ in blue. The upper panel shows the view on the backside of the dimer (facing α12); the lower  panel  shows  the  opposite  frontal  face  with  the  inter‐domain  cavities.  B)  Conservation  of  surface  residues  in  eIF2Bβδ.  Like  in  eIF2Bα2  (see  Figure  S8B)  the  highest  degree  of  sequence  conservation  is  found  on  the  backside  of  the  dimer  around  helix  α12  which  forms  the  interface  for  hexamerization  (Figure  6A/C).  In  addition  to  the  interdomain  cavity,  eIF2Bδ  also  shows  a  high  degree  of  sequence  conservation in the frontal face of the NTD (lower panel) which is not found in eIF2Bα or ‐β and may be  involved in interactions with the eIF2Bγε catalytic subcomplex (dotted circle; see also lower panel in C  and  Figure  6C).  C)  Positions  of  surface  exposed  Gcd‐  (orange;  yeast  numbering)  and  VWM/CACH  mutations (green; human numbering) in eIF2Bβδ; the corresponding residues in the structures of the C.  thermophilum  orthologs  are  given  in  brackets.  D)  Positions  of  Gcn‐  mutations  in  eIF2Bβδ.  Numbers  in  pink correspond to the yeast orthologs; black numbers in brackets give the corresponding residues in C.  thermophilum eIF2Bβ and ‐δ. The orientations in B‐D are the same as in A.    16   

Supplementary Literature    1.  Mueller,  U.,  Darowski,  N.,  Fuchs,  M.R.,  Forster,  R.,  Hellmig,  M.,  Paithankar,  K.S.,  Puhringer,  S.,  Steffien, M., Zocher, G. and Weiss, M.S. (2012) Facilities for macromolecular crystallography at  the Helmholtz‐Zentrum Berlin. J Synchrotron Radiat, 19, 442‐449.  2.  McCoy, A.J., Grosse‐Kunstleve, R.W., Adams, P.D., Winn, M.D., Storoni, L.C. and Read, R.J. (2007)  Phaser crystallographic software. J Appl Crystallogr, 40, 658‐674.  3.  Adams,  P.D.,  Afonine,  P.V.,  Bunkoczi,  G.,  Chen,  V.B.,  Davis,  I.W.,  Echols,  N.,  Headd,  J.J.,  Hung,  L.W., Kapral, G.J., Grosse‐Kunstleve, R.W. et al. (2010) PHENIX: a comprehensive Python‐based  system for macromolecular structure solution. Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 213‐221.  4.  Emsley, P., Lohkamp, B., Scott, W.G. and Cowtan, K. (2010) Features and development of Coot.  Acta Crystallogr D Biol Crystallogr, 66, 486‐501.     

17