Ubiquitin Specific Protease 34 (USP34), a new positive ... - T-Space

4 downloads 28 Views 6MB Size Report
Complex component) we identified the deubiquitinating enzyme USP34 as ... Functional studies showed USP34 functions to positively regulate Wnt signalling,.
         

Ubiquitin Specific Protease 34 (USP34), a new positive  regulator of Canonical Wnt/β‐catenin signalling                  by                  To‐hang (Tony) Lui  A thesis submitted in conformity with the requirements  for the degree of Master of Science    Graduate Department of Pharmaceutical Sciences  Faculty of Pharmacy  University of Toronto              © Copyright by To‐hang (Tony) Lui, 2010 

 

Ubiquitin Specific Protease 34 (USP34), a new positive  regulator of Canonical Wnt/β‐catenin signalling    To‐Hang (Tony) Lui  Master of Science  Graduate Department of Pharmaceutical Sciences  Faculty of Pharmacy  University of Toronto  2010   

Abstract    The  Wnt  pathway  is  a  fundamental  signalling  pathway  conserved  in  all  animals,  regulating  growth,  differentiation,  embryonic  development,  and  tissue  homeostasis  in  adults.  Wnt  signalling  is  kept  quiescent  by  ubiquitin‐mediated  degradation  of  the  transcription  factor  β‐ catenin,  orchestrated  by  a  group  of  proteins  called  the  Destruction  Complex.  Aberrant  Destruction Complex activity is a common theme in many cancers, and is the primary cause of  colon cancer. Through mass spectrometry analysis of Axin protein complexes (a key Destruction  Complex component) we identified the deubiquitinating enzyme USP34 as an Axin‐interacting  protein.    Functional  studies  showed  USP34  functions  to  positively  regulate  Wnt  signalling,  acting downstream of β‐catenin stabilization. While characterizing USP34 we also discovered a  new  positive  regulatory  role  for  Axin  in  promoting  signalling  that  is  dependent  on  its  nuclear  localization.  Our  results  suggest  that  USP34  stabilizes  the  nuclear  pool  of  Axin  through  regulating its ubiquitination and offers a potential strategy to target pathological Wnt signalling.

ii   

Acknowledgments   I  would  like  to  use  this  opportunity  to  sincerely  thank  my  supervisor  Dr.  Stephane  Angers for his tutelage, support, and mentorship in science and in life. I would also like to thank  my advisory committee: Dr. Liliana Attisano and Dr. James Wells for their guidance throughout  my degree. Last, but not least, I would like to express my gratitude to my fellow lab members  past  and  present:  Mukhtar  Ahmed,  Celine  Lacroix,  Natalie  Lavine,  Andrew  Chang,  Dr.  Avais  Daulat, Cherry Liu, and Dr. Melanie Robitaille for their support.    

 

iii   

Table of Contents    Title   

 



Abstract 

 

ii 

Acknowledgments 

iii 

Table of Contents 

iv 

List of Figures and Tables 

vii 

  1.1: Introduction: Wnt (Wingless/Int‐1) 



 

Evolutionary origins 



 

Wnt pathway functions 



 

Canonical signalling 



 

Non‐Canonical signalling 



 

Disease related to Wnt signalling 



  1.2: Canonical Wnt Signalling Pathway Details 

 



 

Wnt production and secretion 



 

The inactive Wnt pathway at steady state 

10 

 

The Destruction Complex 

10 

 

Wnt activation 

11 

 

Nuclear signalling events 

14 

  iv   

1.3: Ubiquitin, Ubiquitin‐Proteasome System (UPS) 

15 

 

Ubiquitination 

16 

 

Mono‐ and poly‐ubiquitination, branching 

18 

 

Proteasome mediated degradation 

19 

 

De‐ubiquitination 

20 

 

Disease caused by UPS disruption 

23 

 

UPS and Wnt signalling 

25 

1.4: Project Hypothesis 

25 

  2.0: Materials and Methods 

27 

 

Plasmid Constructs 

27 

 

Tissue Culture and Transfection 

27 

 

Wnt3A Conditioned Media 

28 

 

Western Blotting/Antibodies 

28 

 

Tandem‐affinity Purification and Mass Spectrometry 

29 

 

TOPFlash Luciferase Reporter Assays 

31 

 

Co‐immunoprecipitation 

32 

 

K48 Chain Cleavage 

32 

 

UBL‐PLA2Assay 

32 

 

Immunofluorescence 

33 

 

β‐catenin stabilization assay 

34 

 

Axin Ubiquitination 

34 

v   

 

Real‐Time Quantitative‐PCR (RT‐QPCR) 

34 

  3.0: Results 

 

 

 

3.1:  Ubiquitin Specific Protease 34 (USP34) found within Axin protein 

35 

 

 

 

3.2:  USP34 confers ubiquitin specific protease activity to the 

 

 

 

3.3:  USP34 positively regulates β‐catenin dependent transcription 

 

 

 

3.4:  A new positive regulatory role for Axin in the Wnt pathway, 

 

 

 

3.5:  USP34 controls the nuclear‐cytoplasmic shuttling of Axin 

43 

 

3.6:  Axin ubiquitination is dynamic 

44 

 

3.7:  USP34 stabilizes Axin, likely via deubiquitination 

45 

complex by mass spectrometry proteomic analysis  36 

Axin complex  38 

downstream of the Destruction Complex  41 

downstream of the Destruction Complex 

4.0: Discussion 

46 

  References 

 

53 

Abbreviations   

79 

 

 

vi   

List of Figures and Tables  Table 1: 

Wnt pathway major components 

65 

Table 2: 

Mass Spectrometry: interactors within Axin1/2 protein complex 

66 

Figure 1. 

Regulation of β‐catenin by the Destruction Complex. 

67 

Figure 2. 

Canonical Wnt Signalling. 

68 

Figure 3. 

The Ubiquitin Cycle. 

69 

Figure 4. 

Identification of the Ubiquitin Specific Protease 34 (USP34) as 

70 

 

an Axin interacting protein 

Figure 5. 

USP34 confers ubiquitin protease activity to the Axin protein 

 

complex. 

Figure 6. 

USP34 has a positive regulatory function in Wnt signalling. 

72 

Figure 7. 

Uncovering a positive regulatory role for Axin in pathological 

74 

 

Wnt signalling. 

Figure 8. 

USP34 controls the nuclear‐cytoplasmic shuttling of Axin. 

76 

Figure 9. 

Ubiquitinated Axin is sensitive to ubiquitin specific protease 

77 

 

activity (USP). 

Figure 10.  USP34 knockdown destabilizes Axin.                  vii   

71 

78 

1.0: Introduction: Wnt (Wingless/Int‐1)  In  1982,  Roel  Nusse  and  Harold  Varmus  discovered  a  preferential  insertion  site  of  the  mouse  mammary tumor virus (MMTV) within the Mus musculus genome at a locus they named Int‐11.  Sequencing  and  alignment  later  revealed  that  the  Drosophila  melanogaster  morphogen  Wingless (Wg) was orthologous to Int‐1, linking Int‐1 to the Wg signalling pathway studied at  the  time  and  hence  the  name  Wnt  (Wg+Int).  There  are  19  Wnt  genes  in  vertebrates,  7  in  arthropods, and 5 in Caenorhabditis elegans2.    In D. melanogaster embryogenesis, Wg acts as a morphogen and is responsible for establishing  body  patterning,  with  high  levels  specifying  development  of  naked  cuticle,  while  low  levels  instructing denticle formation. During larval development Wingless is also needed to promote  wing growth and sensory bristle specification3. These easily observable morphological changes  have  made  the  fruit  fly  a  powerful  research  model,  with  subsequent  genetic  screens  and  epistasis analysis helping to establish the main components and their chain of action within the  Wnt  signalling  pathway.  Analogously,  the  importance  of  Wnt  proteins  for  vertebrate  development  became  clear  with  observations  that  injection  of  Xenopus  laevis  embryos  with  mouse  Wnt1  mRNA  resulted  in  embryos  with  two  heads4.  This  experiment  established  that  Wnts  are  important  for  dorsal  axis  specification  and  provided  the  framework  to  study  the  signalling pathways controlled by Wnt proteins during animal development. The discovery that  the  main  Wg  signalling  components  such  as  Frizzled  (Fz),  Arrow  (LRP),  Zeste‐white  (GSK3),  Dishevelled  (Dvl)  and  Armadillo  (‐catenin)  have  vertebrate  homologs  (Table  1)5  further  highlighted that this pathway is evolutionary conserved.  1   

 

1.1: Evolutionary origins  Wnt signalling developed very early in the evolutionary history of multi‐cellular animals; the sea  anemone  Nematostella  vectensis  (Cnidaria)  shares  18  of  the  19  vertebrate  Wnt  genes2,  while  the sponge Oscarella carmela (Porifera) also shares many pathway components including Wnt,  Frizzled,  Dickkopf,  β‐catenin,  and  Dishevelled6.  Cnidaria  and  Porifera  are  sister  branches  to  Bilataria (vertebrates and all other animals), which diverged over 550 million years ago, before  the  Cambrian  explosion7,8.  The  basic  functions  of  these  conserved  proteins  have  also  been  retained, with β‐catenin being responsible for specifying oral‐aboral axis during gastrulation in  N.  vectensis9,  much  as  it  does  for  D.  melanogaster  and  for  vertebrates.  This  evolutionary  conservation  suggests  a  primordial  and  important  function  for  the  Wnt  pathway  in  all  multi‐ cellular animals.   

1.2: Wnt pathway functions  One common interpretation of our knowledge of Wnt signalling has been to divide the pathway  into  at  least  two  molecularly  distinct  branches  that  produce  different  cellular  responses.  The  more  studied  of  the  two  has  been  termed  the  Wnt/‐catenin  or  Canonical  pathway  and  is  involved  in  specifying  cell  fate  and  regulating  cellular  proliferation10.  As  its  name  implies,  the  activity of the Wnt/β‐catenin pathway requires the function of the transcriptional co‐activator  ‐catenin.   

2   

The second branch is the less well defined Non‐Canonical pathway, responsible for establishing  cell polarity and is also  implicated in some instances of cell motility, such as the migration of  cells  during  convergence  and  extension  movements  during  gastrulation11.  This  distinction  between Canonical and Non‐canonical signalling is merely a simplification, as there is increasing  recognition that Wnt signalling is more complex and depends on spatial and temporal contexts,  such as the presence of unique regulatory factors or the differential expression of ligands and  receptors12.   

1.2.1: Canonical Wnt signalling   Canonical  Wnt  signalling  is  well  known  for  establishing  the  dorsal‐ventral  axis  in  vertebrates,  body segmentation in D. melanogaster, development of the gut in C. elegans13, and also acts in  tandem with Notch signalling in somite patterning in mice10. Dorsal‐ventral axis formation is a  critical  developmental  process  that  is  evolutionarily  conserved  and  easily  observable  in  common  vertebrate  model  organisms  such  as  zebrafish  and  Xenopus,  which  have  become  invaluable tools for studying this pathway. In this context, β‐catenin signalling is important for  the  specification  of  the  dorsal  axis  of  the  embryo.  Furthermore,  recent  in  vivo  studies  using  these models have established a fundamental role for maternally deposited Wnt11 ligand as a  dorsalizing factor in the embryo acting as early as the 4 cell stage14. Canonical signalling is also  implicated  in  generating  the  neural  crest15,  and  establishing  posterior  structures  such  as  the  hindbrain  and  spinal  cord  during  central  nervous  system  development16.  In  addition  to  its  importance in early developmentt, the pathway is also critical in adults for tissue homeostasis.  Indeed, the maintenance of several adult stem cell populations has been demonstrated to be  3   

under the influence of Wnt proteins17. One particularly well studied example is the control of  intestinal stem cells that supports the rapid turnover of the intestinal epithelium17. Bulge cells  in the hair follicle responsible for hair growth and hematopoietic stem cells (HSCs) of the bone  marrow also require canonical Wnt signalling to achieve homeostasis18.    At  the  molecular  level,  canonical  Wnt  signalling  revolves  around  the  post‐translational  regulation  of  the  transcription  factor  β‐catenin.  Under  resting  conditions,  β‐catenin  is  constantly  targeted  for  ubiquitin‐mediated  degradation  by  a  cytoplasmic  protein  complex  named  the  Destruction  Complex,  an  assembly  of  proteins  that  include  Axin,  Adenomatous  Polyposis  Coli  (APC),  as  well  as  the  protein  kinases  Casein  Kinase  1α  (CK1α)  and  Glycogen  Synthase  Kinase  3β  (GSK3).  The  role  of  the  Destruction  Complex  is  to  orchestrate  the  phosphorylation  and  presentation  of  β‐catenin  to  β‐TrCP  (an  E3  ubiquitin  ligase,  see  chapter  3.1: Ubiquitination) for ubiquitination and subsequent degradation by the proteasome19. Thus,  under  resting  conditions,  the  cellular  levels  of  ‐catenin  are  kept  low  by  the  activity  of  the  Destruction Complex.    A subgroup of Wnt proteins such as Wnt1, Wnt3a, and Wnt813 have been shown to interact and  activate the Frizzled and LRP6 receptors at the cell surface and to stimulate the Wnt/‐catenin  pathway. Once activated, Frizzled can engage the cytoplasmic protein Dishevelled (Dvl) which  disrupts the formation and function of the Destruction Complex. This causes an accumulation of  newly  synthesized  β‐catenin  (no  longer  ubiquitinated  and  degraded)  that  can  then  enter  the 

4   

nucleus  where  it  acts  as  a  transcriptional  co‐activator  to  initiate  transcription  of  Wnt  target  genes.   

1.2.2: Non‐canonical signalling  In addition to the canonical/β‐catenin pathway, Wnt‐activated Frizzled (Fz) receptors can also  stimulate  at  least  two  other  molecularly  distinct  signalling  pathways  that  do  not  involve  β‐ catenin: the Planar Cell Polarity (PCP) pathway and the Wnt Ca2+ pathway. These pathways are  alternatively classified as β‐catenin‐independent or Non‐Canonical signalling pathways.    The  PCP  pathway  provides  a  means  for  the  cell  to  sense  polarity  within  its  environment.  In  addition to the well characterized apical basal polarity, cells also exhibit polarity with respect to  the plane of the epithelium. PCP signalling plays a crucial role in D. melanogaster development  where it is important in establishing the chiral/asymmetric arrangement and orientation of the  photoreceptor  cells  within  each  ommatidia  in  the  eye  and  in  coordinating  the  hairs  of  the  wings20. Each Drosophila wing cell produces a single hair at the distal tip of the cell with all the  hairs pointing in the same direction in wild‐type flies. When PCP proteins are mutated, defects  in hair polarity and ommatidia orientation are observed. These easily observable outcomes of  PCP  signalling  have  established  Drosophila  as  an  important  model  organism  for  studying  the  non‐canonical Wnt pathway and have allowed the identification of several pathway members.    PCP  signalling  is  also  critical  for  tissue  organization  during  vertebrate  development.  One  well  characterized role of PCP signalling in vertebrates is the polarized organization of auditory hair  5   

cells  of  the organ  of  Corti,  within  the  inner ear21. Another context where PCP signalling plays  important  roles  is  during  convergence  and  extension  cell  movements  during  embryonic  gastrulation.  These  polarized  cell  movements  allow  mesodermal  cells  to  migrate  towards  the  midline (convergence), intercalate together and allow the extension of the developing embryos  into the anterior‐posterior axis.22  Wnt proteins such as Wnt5a and Wnt11 that are not typically  activating the β‐catenin pathway have been found to regulate these processes23. Several of the  Drosophila PCP protein homologues have also been described to participate in these polarized  cell movements in vertebrates24.    Although  Non‐canonical  and  Canonical  pathways  share  several  components,  namely  Wnt  proteins  binding  to  Fz  receptors  and  downstream  activation  of  the  protein  Dishevelled  (canonical pathway reviewed in depth in Chapter 2.4), the PCP pathway utilizes a different set  of  molecules  including  Flamingo,  Prickle,  Vangl,  and  Diego,  while  the  Wnt/Ca2+  pathway  involves  activation  of  Calcium/Calmodulin‐dependent  kinase  II  (CamKII)  and  PKC.  Both  pathways are thought to lead to reorganization of the cytoskeleton as a means of generating  polarity  and  modulating  cell  adhesion  for  mobility22.  However,  these  β‐catenin  independent  pathways are not completely functionally detached from canonical signalling as stimulation of  non‐canonical signalling can inhibit canonical pathway activity25.    Activation  of  these  β‐catenin  independent  pathways  does  not  directly  result  in  cellular  proliferation  and  mutations  and  these  pathways  have  been  less  frequently  associated  with 

6   

human cancers and other diseases. Since my thesis is focused on the canonical Wnt/‐catenin  signalling, I will not review these non‐canonical pathways in detail here.   

1.3: Diseases related to Wnt signalling  Because  of  its  fundamental  role  in  development  and  homeostasis,  dysregulation  of  Wnt  signalling  has  serious  consequences  and  has  been  found  to  be  the  cause  of  several  human  diseases. One clear example is colon cancer, the second leading cause of cancer‐related deaths  in Canada, with an estimated 22,000 new cases and 9,100 deaths in 200926.     Wnt  signalling  was  found  to  be  constitutively  activated  in  colon  cancers  from  patients  with  inherited  Familial  Adenomatous  Polyposis  (FAP)27,  where  the  tumour  suppressor  gene  APC  is  mutated28. Patients with FAP develop several hundred benign colon adenomas (or polyps) that  eventually progress to malignant carcinomas following additional cancer promoting mutations.  Furthermore, almost 90% of sporadic colon cancers exhibit aberrant Wnt signalling30, of which a  majority  (80%)  stems  from  mutations  in  APC29,  and  to  a  lesser  degree,  from  mutations  in  β‐ catenin and Axin31 . Regulation of Wnt/‐catenin signalling is thus critical to maintaining normal  colonic homeostasis and perturbation of this pathway leads to colon cancer.    Our  understanding  of  the  etiology  of  colon  cancer  has  increased  the  recognition  of  Wnt  involvement in other cancers due to pathway dysregulation18. In chronic myelogenous leukemia  (CML) the fusion protein BCR‐ABL can only transform hematopoietic stem cells (HSCs) capable  of  self‐renewal,  a  process  controlled  by  Wnts,  into  leukemic  cancer  stem  cells32.  Wnt1  and  7   

Wnt2 appear to be upregulated in non‐small‐cell lung cancers (NSCLCs) along with loss of the  Wnt  antagonists  WIF‐1  and  sFRP133.  Many  mouse  models  of  breast  cancer  exhibit  a  high  incidence and early onset of mammary tumours, primarily due to congenital transmission of the  Mouse  Mammary  Tumour  Virus  (MMTV)34,  which  induces  tumourigenesis  by  causing  Wnt‐1  over‐expression1.  In  hepatocellular  carcinomas  (HCCs)  alteration  of  Wnt  signalling  due  to  mutations in β‐catenin account for 18% of cases35, with mutations in other components such as  Axin also found in 5% of HCCs36.    Disruption of canonical signalling is also increasingly recognized in other diseases. Evidence has  been  mounting  that  neurodevelopmental  defects  significantly  contribute  to  Schizophrenia37,  with  Disrupted  in  Schizophrenia  1  gene  (DISC1)  (first  gene  found  highly  associated  with  this  disease)  shown  to  be  required  for  maintaining  neuro‐progenitor  cells  through  promoting  canonical Wnt signalling38. One hallmark of Alzheimer’s Disease (AD) is the accumulation of β‐ amyloid  and  hyperphosphorylated  tau  proteins  that  lead  to  neurotoxicity,  both  leading  to  increased  GSK3  activity  and  reduced  β‐catenin  levels39,40.  Indeed  Wnt  pathway  stimulation  is  neuroprotective  and  can  ameliorate  some  behavioral  deficiencies  of  AD  in  animal  models41.  Familial  Exudative  Vitreoretinopathy  (FEVR)  is  an  example  of  canonical  pathway  malfunction  affecting the Wnt receptors. Pediatric FEVR patients suffer vision loss due to progressive retina  deterioration  (abnormal  vascularization),  ultimately  leading  to  retinal  detachment.  It  is  now  known that FEVR is caused by mutations in Frizzled4 and Norrin (a Wnt‐like ligand)42 and less  frequently in LRP5/6.   

8   

2.0: Canonical Wnt Signalling Pathway  2.1: Wnt production and secretion  Wnts are a set of small hydrophobic proteins (38‐42 kDa) characterized by a unique pattern of  cysteine  residues,  glycosylation  sites,  and  an  N‐terminal  signal  sequence.  The  signature  alignment  of  these  conserved  cysteines  is  often  used  to  identify  Wnt  proteins  in  different  organisms43.    Newly  synthesized  Wnt  protein  is  lipid‐modified  with  palmitic  acid  by  the  acyltransferase  Porcupine (Porc) within the Endoplasmic Reticulum (ER). This lipid modification is required for  subsequent  glycosylation  and  lipoprotein  binding,  which  help  target  it  for  exocytosis  and  extracellular  distribution44  (lipoproteins  may  also  help  the  interaction  with  heparin  sulfate  proteoglycans (HSPGs) in the extracellular matrix (ECM) and aid Wnt diffusion45).     Palmitoylated and glycosylated Wnt is then transported to the Golgi network, where it is bound  to  the  transmembrane  protein  Wntless  (Wls)46.  Wntless  carries  Wnt  from  the  Trans‐Golgi‐ Network  (TGN)  to  the  cell  surface  via  vesicles  where  it  is  released  in  the  extracellular  environment47. Wls is then retrieved from the plasma membrane by endocytosis and degraded,  or  recycled  for  further  use  by  the  retromer  complex;  a  mechanism  for  recycling  endosomal  components  that  are  otherwise  destined  for  lysosome  degradation  (e.g.  surface  receptors)43.  Retromer mediated recycling of Wls seems to be necessary for releasing sufficient Wnt for long  range signalling48 

9   

 

2.2: The Wnt pathway at steady state  Canonical  Wnt  signalling  is  peculiar  in  many  aspects,  starting  with  the  dual  nature  of  the  transcription factor/junctional protein β‐catenin. β‐catenin is an essential subunit of adherens  junctions, working in tandem with α‐catenin to anchor actin cytoskeleton filaments to plasma  membrane  cadherins49  and  essential  for  cell‐cell  adhesion.  β‐catenin  can  be  targeted  to  adherens  junctions  via  serine/threonine  phosphorylation  by  Casein  Kinase  II  (CK2)50  while  junctional β‐catenin can be released via tyrosine phosphorylation by receptor tyrosine kinases  (RTKs)51.  β‐catenin  can  also  exist  in  the  cytoplasm  and  in  the  nucleus,  and  it  is  this  non‐ membrane  bound  pool  that  is  responsible  for  Wnt  signalling.  Whether  β‐catenin  can  shift  between  these  distinct  pools  is  still  controversial51  and  in  C.  elegans  the  junctional  and  transcriptional  roles  are  fulfilled  by  two  distinct  β‐catenin  homologs  (HMR‐1  and  BAR‐1  respectively)52.     At  resting  state,  the  small  fraction  of  β‐catenin  not  localized  to  the  adherens  junctions  is  actively  phosphorylated  by  the  Destruction  Complex,  targeted  for  ubiquitination  and  rapidly  degraded  via  the  proteasome.  Although  this  unique  regulation  may  seem  futile  as  cells  constantly  produce  and  destroy  β‐catenin  to  keep  the  pathway  inactive,  it  offers  a  very  tight  control of pathway activity by controlling the cellular levels of ‐catenin and allowing the cell to  sensitively and rapidly respond to circulating levels of Wnt proteins.    

2.3: The Destruction Complex  10   

The  Destruction  Complex  is  a  cytoplasmic  assembly  of  several  proteins  that  coordinate  the  phosphorylation and ubiquitination of β‐catenin, targeting it to the proteasome for destruction.  It is composed of the kinases Casein Kinase 1α (CK1α) and Glycogen Synthase Kinase 3 (GSK3β),  both  anchored  to  the  scaffold  protein  Axin,  which  is  also  bound  to  the  tumour  suppressor  Adenomatous Polyposis Coli (APC)19.    β‐catenin  binding  to  Axin  initiates  a  ‘priming’  phosphorylation  of  β‐catenin  at  residue  S45  by  CK1α53,  subsequently  allowing  GSK3β  to  sequentially  phosphorylate  residues  T41,  S37,  and  S3354.  Phosphorylated  β‐catenin  is  very  vulnerable  to  dephosphorylation  by  Protein  Phosphatase  2A  (PP2A),  and  must  be  protected  by  APC55  in  order  to  be  recognized  as  a  substrate for ubiquitination by β‐Transducin repeat‐Containing Protein (β‐TrCP), a component  of the SCFβ‐TrCP ubiquitin ligase machinery (see Chapter 3.0: Ubiquitin for details). Following K48  poly‐ubiquitination,  β‐catenin  is  consigned  to  destruction  via  proteasome‐mediated  proteolysis56.  Although  β‐catenin  regulation  (and  pathway  inhibition  at  steady  state)  involves  many steps, APC is especially important within this complex since several mutations in APC that  result  in  the  inactivation  of  Destruction  Complex  function  and  hyperactive  Wnt/‐catenin  signalling have been identified in human cancers (Figure 1).   

2.4: Wnt pathway activation  Various receptors for the Wnt proteins can be found at the cell surface. The Frizzled receptor  (Fz), which belongs to the seven‐pass transmembrane G‐protein coupled receptor family, were  the first Wnt receptors discovered and are the best characterized57,58, with 4 D. melanogaster  11   

and  10  vertebrate  isoforms.  Fz  receptors  bind  their  ligands  (primarily  Wnts)  through  an  extracellular N‐terminal Cysteine Rich Domain (CRD), and are involved in signal transduction for  both  the  canonical  and  non‐canonical  Wnt  pathways59.  Different  Fz  receptors  also  exhibit  overlapping  specificity  towards  Wnt  ligands57  but  it  is  commonly  thought  that  specific  Wnts  interact  preferentially  with  given  Fz  receptors  to  allow  for  signalling  specificity.  Unique  to  canonical  signalling,  Fz  also  associates  with  the  single‐transmembrane  domain  Low  density  lipoprotein Receptor‐related Protein 5 and 6 (LRP5/6) that act as co‐receptors to interact with  Wnt proteins and initiate the activation of the pathway60.     Aside from Frizzled, the tyrosine kinase receptors Ryk and Ror have recently been identified as  atypical Wnt receptors. Ror binds Wnt via a similar CRD, while Ryk interacts with Wnts via a WIF  (Wnt Inhibitory Factor) domain. In D. melanogaster the Ryk homolog Derailed binds Wnt5a and  guides  neuron  guidance61  while  vertebrate  Ryk  has  recently  been  shown  to  be  important  for  neurogenesis62. Ror2 on the other hand has been shown to help Wnt5a‐mediated convergent  extension in Xenopus63 and to be required for non‐canonical Wnts to inhibit the Wnt/‐catenin  pathway64.    In  addition  to  Wnt  proteins,  other  endogenous  pathway  agonists  and  antagonists  have  been  found.  The  protein  Norrin,  mutated  in  Norrie  disease  (congenital  blindness),  can  activate  canonical signalling through Fz4 binding, and is important for vascular development of the eye  and ear65. The Wnt inhibitor Dickkopf (Dkk) blocks signalling by binding to LRP6 and causing its 

12   

internalization66,  while  Wnt  Inhibitory  Factors  (WIFs)  and  Soluble  Frizzled‐Related  Proteins  (SFRPs) are secreted proteins that sequester Wnt44 in the ECM.    The  Fz‐LRP6  receptor  complex  recognizes  Wnt  proteins  and  is  responsible  for  canonical  signalling. Wnt binding to Fz promotes the formation of the Fz‐LRP6‐Wnt complex, leading to  activation of the cytoplasmic protein Dvl. Activated Dvl then disrupts the Destruction Complex  by promoting Axin binding to LRP6 at the plasma membrane. GSK3 (previously recognized for  phosphorylating  β‐catenin  for  ubiquitination/degradation)  and  CK1γ  phosphorylate  LRP6,  thereby producing more high affinity docking sites for Axin. Because Axin is the least abundant  component  of  the  canonical  signalling  pathway  the  net  result  of  Wnt‐induced  Axin  sequestration  to  LRP6  is  a  disruption  of  the  cytoplasmic  Destruction  Complex67,68.  This  effectively releases β‐catenin from ubiquitination and degradation and allows it to accumulate  in the cytoplasm and enter the nucleus to initiate signalling (Figure 2). It is interesting to note  the  dual  and  opposite  roles  GSK3  plays  in  this  system,  first  as  a  negative  regulator  by  phosphorylating  β‐catenin  for  ubiquitination,  then  as  a  positive  regulator  by  promoting  Axin  recruitment to LRP6. Although we now understand how the major components act together to  initiate  and  propagate  Wnt  signalling,  many  questions  remain:  how  is  Wnt  stimulation  quantified/translated  into  proportionate  levels  of  β‐catenin  for  signalling?  Are  there  mechanisms in place to deactivate signalling, perhaps through dephosphorylation of Axin‐LRP6  complexes?  What  regulates  Axin  dissociation  from  the  Destruction  Complex,  and  how  is  that  controlled?  Answering  these  questions  will  provide  new  insights  into  the  mechanism  of 

13   

canonical  signalling  and  potentially  allow  us  to  derive  new  means  of  controlling  the  aberrant  signalling that is the source of many diseases.   

2.5: Nuclear signalling events  The mechanism of β‐catenin entry into the nucleus is yet to be fully elucidated, but it is known  that  β‐catenin  lacks  defined  nuclear  localization  sequences (NLS),  and  that  its  translocation  is  independent  of  importins,  the  main  machinery  regulating  nuclear  import69.  Recent  work  has  found  that  the  phosphorylation  of  the  β‐catenin  C‐terminus  at  S191  and  S605  by  c‐Jun  N‐ terminal Kinase 2 (JNK2) appears to be required for nuclear import70, while glycosylation may  also  play  a  role  in  blocking  nuclear  entry71.  Axin  and  APC,  two  critical  members  of  the  Destruction  Complex,  also  contain  active  nuclear  localization  and  nuclear  export  signals  (NLS,  NES  respectively)  allowing  them  to  shuttle  between  the  cytoplasm  and  the  nucleus72,73,  presenting  one  possible  mechanism  of  β‐catenin  nuclear  accumulation/export.  However,  another  study  examining  the  kinetics  of  β‐catenin  transport  between  the  cytoplasm  and  the  nucleus concluded that Axin and APC merely act passively in anchoring β‐catenin to a particular  subcellular compartment74.    Although  the  means  by  which  β‐catenin  can enter  the  nucleus  is  debated,  it  has been  shown  that  only  N‐terminally  dephosphorylated  β‐catenin  (sites  of  GSK3β  phosphorylation75)  can  promote  canonical  Wnt  signalling.  Despite  proteasome  inhibitor  (ALLN,  MG132)  induced  accumulation  of  β‐catenin,  only  N‐terminally  dephosphorylated  β‐catenin  appears  competent  at triggering Wnt target gene expression both in vitro76 and in vivo77.  14   

  Upon  entering  the  nucleus,  β‐catenin  acts  as  a  co‐activator  by  displacing  the  transcriptional  repressor  Groucho/TLE  from  the  T‐Cell  Factor  (TCF)/Lymphoid  Enhancer‐binding  Factor  (LEF)  DNA  binding  transcription  factor78  and  initiate  the  transcription  of  Wnt  target  genes,  such  as  Axin2, Naked1, and Troy79 (Figure 2).    Interestingly,  many  of  the  components  involved  in  canonical  signalling  also  have  regulatory  functions  within  the  nucleus,  but  their  effects  may  not  necessarily  coincide  with  their  cytoplasmic  functions.  In  D.  melanogaster,  in  addition  to  its  negative  role  in  the  Destruction  Complex,  cytoplasmic  APC  can  also  positively  regulate  signalling  through  down‐regulating  Axin80,  while  nuclear  APC  can  also  repress  Wnt  signalling  by  promoting  histone  H3K4  deacetylation  via  recruitment  of  CtBP81.  In  addition  to  its  role  in  the  cytoplasm  to  inhibit  the  Destruction Complex, it appears that Dvl also localizes to the nucleus where it has been found  to  promote  signalling  via  stabilizing  the  interaction  between  β‐catenin  and  TCF82.  Nuclear  β‐ TrCP interacts with and enhances transcription by β‐catenin‐TCF (a positive regulatory role), in  contrast  to  its  negative  role  within  the  SCFβ‐TrCP  E3  ligase  responsible  for  ubiquitinating  β‐ catenin83. Axin has also been found to shuttle between the cytoplasm and the nucleus, but at  this point the functional relevance of this behaviour is unknown72.    

3.0: Ubiquitin, Ubiquitin‐Proteasome System (UPS)  Cellular  protein  homeostasis  is  achieved  through  a  balance  of  synthesis  and  turnover  by  dynamic regulation of transcription and protein degradation. Ever since Rudolf Schoenheimer  15   

demonstrated  the  in  vivo  incorporation  of  radiolabeled  dietary  amino  acids  into  cellular  proteins almost 70 years ago, protein degradation has been recognized as a fundamental and  critical cellular process. Eukaryotes employ two major pathways for protein turnover: lysosome  mediated general proteolysis by acidic proteases and the precisely tuned ubiquitin‐proteasome  degradation of targeted proteins that is responsible for destroying most endogenous proteins84.  80‐90% of protein breakdown is mediated by the ubiquitin‐proteasome system85.     Ubiquitin  is  a  small  (76aa,  8.5kDa)  heat  stable  protein  that  is  strongly  conserved  in  all  eukaryotes. It was first isolated from mice thymus extracts86 in 1966 as a putative stimulator of  T‐cell differentiation, but was refuted as an artifact of endotoxin contamination. A decade later  in 1977, Ubiquitin was found covalently linked to histones H2A/H2B87 but its function was not  elucidated  until  recently  as  a  regulator  of  histone  methylation88.  At  the  same  time  the  Ubiquitin‐histone  association  was  being  characterized,  Ciechanover,  Hershko  and  Rose  found  ‘APF‐1’ (ATP‐dependent Proteolysis Factor 1) which they believed to be responsible for the non‐ lysosomal  degradation  of  intracellular  proteins.  This  led  to  the  realization  that  APF‐1  and  Ubiquitin were the same protein and to the discovery that it functioned as a molecular tag for  selective and controlled protein degradation89.   

3.1: Ubiquitination  Ubiquitin and its homologous molecules Nedd8, Sumo, and ISG15 (Ubls, ubiquitin‐like protein  modifiers) all share a characteristic ‘ubiquitin fold’ structure, along with a C‐terminal di‐glycine  that forms an isopeptide bond with an amino group of the target protein. The ε‐amino group of  16   

lysine is the most common ubiquitin acceptor, while N‐terminal binding is also possible. Protein  ubiquitination  is  a  three  step  process  catalyzed  by  distinct  enzymes  at  each  stage.  Free  ubiquitin must first be activated by an ATP‐dependent mechanism by the E1 enzyme, followed  by  transfer  to  an  E2  conjugating  enzyme  that  transfer  ubiquitin  to  a  target  substrate  in  coordination  with  the  E3  ubiquitin  ligase  which  provide  the  specificity  for  substrate  recognition90 (Figure 3).    The human genome has 11 genes coding for Ubiquitin and Ubls, along with 13 E1 enzymes that  process  the  Ubls,  with  two  E1  genes  specific  for  Ubiquitin.  E2  conjugating  enzymes  are  more  varied  with  49  types,  conferring  selectivity  towards  different  E3  ligases91  and  may  also  affect  the type of ubiquitin chain that is ligated to a given target protein (see below). E3 ligases are  the  most  diverse  with  617  genes  predicted  in  the  human  genome,  facilitating  precise  discrimination  of  target  proteins  and  insuring  the  specificity  of  the  three‐step  conjugation  process92.  E3  ligases  are  classified  into  three  types:  Homologous  to  E6AP  Carboxy  Terminus  (HECT), Really Interesting New Gene (RING), and UFD2 homology (U‐box)90.    In  canonical  Wnt  signalling,  phosphorylated  β‐catenin  is  recognized  by  β‐TrCP,  the  F‐box  component of the SCF complex (RING‐type E3 ligase). The SCF complex has four units: an F‐box  protein  that  binds  the  phosphorylated  substrate,  an  E2  binding  protein  Rbx1  (the  ring  finger  protein),  the  scaffold  Cullin  (Cul1),  and  the  Skp1  adaptor  that  joins  F‐box  to  Cullin  (Figure  1),  this complex is responsible for ubiquitinating β‐catenin93.   

17   

3.2: Mono‐ and poly‐ubiquitination, ubiquitin chains  Ubiquitin  itself  contains  seven  lysines  (K6,  11,  27,  29,  33,  48,  63),  making  it  susceptible  to  further  conjugation  by  ubiquitin  units  thereby  forming  polyubiquitin  chains  with  unique  branching  structures  depending  on  which  lysine  residues  are  utilized.  Unique  types  of  poly‐ ubiquitination and branching of such chains add an extra layer of complexity thereby increasing  the possibilities for functional roles. K48‐linked ubiquitin chains longer than 4 units, where each  unit is linked to lysine 48 of the preceding ubiquitin, is the most well known poly‐ubiquitin tag  and constitutes a signal that targets the modified protein for degradation by the proteasome94.  K63‐linked  ubiquitination  is  another  common  signal  with  roles  reported  to  regulate  kinase  activation, vesicle trafficking, and DNA repair95.    Proteins  can  also  be  modified  with  only  one  ubiquitin  residue  in  a  process  termed  monoubiquitination.  Mono‐ubiquitin  signals  are  involved  in  many  different cellular  processes,  such  as  endocytosis  of  plasma  membrane  proteins,  viral  vesicle  budding/release,  post‐ translational protein sorting by the Trans‐Golgi Network96 and nuclear‐cytoplasmic shuttling of  proteins.  Mono‐ubiquitination  also  plays  an  important  role  in  chromosomal  remodelling.  Indeed, Histone H2B monoubiquitination (residue K123) is required for H3 methylation (residue  K4) and subsequent transcriptional activation88.    Moreover, varying the type of ubiquitin‐like molecules conjugated at a single amino acid locus  on  a  protein  can  achieve  different  functional  effects.  For  example,  the  behaviour  of  the  Proliferating Cell Nuclear Antigen (PCNA) protein depends on whether it is conjugated to SUMO  18   

or  Ubiquitin.  Under  normal  circumstances,  PCNA  is  tagged  by  SUMO  at  K164,  driving  PCNA  activity towards promoting DNA replication97. DNA damage leads to replacement of SUMO by  monoubiquitin  at  K164  and  promotes  DNA  repair  by  trans‐lesion  polymerases  (error‐prone),  while  K63  poly‐ubiquitination  at  the  same  site  leads  to  repair  using  a  template  of  the  sister  duplex  (error‐free)98.  NMR  studies  of  K48  and  K63  ubiquitin  linkages  suggest  the  unique  properties  of  each  chain  is  due  to  conformational  differences,  with  K48  ubiquitin  chains  exhibiting a compact structure while K63 having a more open and extended conformation99.   

3.3: Proteasome mediated degradation  The 26S Proteasome holoenzyme is a large protein complex of 2.5MDa in size, consisting of the  19S  Regulatory  Particle  and  the  20S  Core  Particle.  The  20S  subunit  is  a  hollow  cylindrical  complex containing proteolytic active sites facing the inner surface. Proteins are blocked from  random entry by the 19S Regulatory unit, which serves as a cap on the open sides of the 20S  Core  and  can  selectively  bind,  de‐ubiquitinate,  unfold,  and  translocate  K‐48  ubiquitinated  proteins  into  the  20S  core  unit  in  an  ATP‐dependent  manner.  The  compact,  hydrophobic  surface  of  K48  chains  seems  to  be  responsible  for  affinity  towards  the  19S  Regulatory  unit89.  Once the substrate is bound to the proteasome, protein unfolding is initiated in unstructured  regions  of  the  substrate  and  the  protein  begins  entry  into  the  20S  core  unit  for  proteolysis100,101.     Proteasome  mediated  protein  degradation  occurs  primarily  in  the  cytoplasm,  where  it  participates  in  protein  quality  control,  cellular  signalling,  foreign  antigen  processing,  and  19   

general protein turnover89. An estimated 30% of newly synthesized proteins do not pass quality  control  checkpoints  for  proper  folding  and  assembly  and  are  quickly  degraded  by  the  proteasome102.  Internalization  of  some  membrane  proteins  for  degradation  or  recycling  can  also  be  mediated  by  ubiquitination/neddylation103.  Proteins  destined  for  extracellular  export  must unfold to enter the endoplasmic reticulum for trafficking, and are also subject to quality  control  by  Endoplasmic  Reticulum  Associated  Degradation  (ERAD)  where  defective  proteins  undergo  retrograde  transport  back  to  the  cytoplasm  for  destruction104.  Misfolded  and  otherwise  defective  proteins  can  be  harmful  if  they  aggregate  and  precipitate  (in  the  case  of  Creutzfeldt‐Jakob, Alzheimer’s, and Parkinson’s diseases)105. The processing of foreign proteins  (eg. viral proteins) into short peptides by the proteasome is also a critical step in the generation  of  antigens  for  initiating  immune  responses89.  The  proteasome  also  functions  within  the  nucleus, facilitating nuclear protein turnover and also in modulating transcription through the  non‐proteolytic  function  of  the  19S  regulatory  unit  that  acts  by  recruiting  chromatin  remodelling factors106.   

3.4: De‐ubiquitination  Analogous  to  other  covalent  protein  modifications  (phosphorylation,  methylation),  ubiquitination is dynamic and reversible. The removal or cleavage of ubiquitin is mediated by  deubiquitinating enzymes (DUBs). Currently there are 79 predicted functional DUBs encoded by  the  human  genome.  DUBs  are  classified  into  two  major  groups  based  on  their  enzymatic  mechanism: cysteine proteases (USP, UCH, OTU, and MJD domain Dubs), and metalloproteases  (JAMM  domain).  JAMM  domain  DUBs  employ  Zn2+  to  catalyze  ubiquitin  cleavage,  while  the  20   

cysteine proteases utilize a catalytic triad of cysteine‐histidine‐aspartate residues in their active  site.  Cysteine  protease  DUBs  are  further  divided  based  on  the  structure  and  sequence  homology  of  their  catalytic  domains:  Ubiquitin  C‐terminal Hydrolases  (UCH),  Machado‐Joseph  Disease  Protein  Domain  Proteases  (MJD),  Ovarian  Tumor  Proteases  (OTU),  and  Ubiquitin  Specific  Proteases  (USP),  with  USPs  being  the  largest  subgroup107.  Interestingly,  some  viruses  have  also  evolved  their  own  unique  deubiquitinases  (no  homology  to  human  DUBs)  to  counteract the proteasomal processing of ubiquitinated foreign material to generate antigens  in order to benefit infection108.    DUBs  have  been  described  to  serve  four  important  roles  within  the  cell:  1.  Cleave  de  novo  synthesized  ubiquitin  into  monomer  units  (Ubls  are  coded  as  inactive  multimers  or  fusion  proteins89);  2.  Editing  or  rescue  of  ubiquitinated  proteins  (both  proteolysis  dependent  and  independent  roles);  3.  Removal  of  ubiquitin  conjugates  from  proteins  to  allow  entry  into  the  proteasome  for  degradation;  and  4.  Recycling  of  free  polyubiquitin  chains  (from  #3)  into  monomers  (reviewed  in  4).  Through  these  functions  DUBs  maintain  a  steady  supply  of  free  ubiquitin and regulate the stability and/or localization of targeted proteins.    Out of the 79 putative DUBs, only three DUBs (POH1, UCH‐L5, USP14) are known to operate at  the  proteasome  to  deubiquitinate  proteins  and  facilitate  their  unfolding  and  entry  into  the  proteolytic 20s core89. DUBs have been implicated in a wide range of critical cellular processes,  regulating  transcription109,  endocytosis110,  protein  stability111  and  protein  localization112.  For  example, many histones are ubiquitinated, and deubiquitination of H2B by Ubp8 is required for 

21   

efficient transcription109. Following activation, many receptors are ubiquitinated, which acts as  a signal for internalization. Upon activation, the T‐cell Receptor (TCR) is ubiquitinated by the Cbl  E3 ligase, leading to endocytosis of the receptor and entry into the endosomal sorting complex.  If  TCR  remains  mono‐ubiquitinated,  it  is  targeted  to  the  lysosome  for  degradation,  while  deubiquitinated TCR (by the deubiquitinase DUB‐2113) can be recycled back to the surface for  reuse. Disruption of this endocytic process can attenuate ligand‐dependent down‐regulation of  the receptor and cause hypersensitivity110.    DUBs also play a key role in the regulation of some transcription factors. For example the proto‐ oncogene  MYC  is  ubiquitinated/degraded  in  the  nucleus  by  FBW7  (a  F‐box  E3  ligase),  but  is  stabilized by USP28 (which is also required for tumour proliferation)111. DUBs can also indirectly  control  protein  levels  by  regulating  the  stability  of  E3  ligases.  Under  normal  conditions  the  stress sensor/tumour suppressor p53 is constitutively degraded by the E3 ligase MDM2, which  is  stabilized  by  USP7/HAUSP  (HAUSP  has  affinity  for  both  p53  and  Mdm2).  Upon  exposure  to  stress  (hypoxia,  DNA  damage,  oncogene  activation)  HAUSP  preferentially  associates  with  and  deubiquitinates p53 rather than Mdm2, protecting p53 from degradation114.     HAUSP also acts on the FOXO family of transcription factors, but in a degradation independent  fashion.  The  mono‐ubiquitination  of  FOXO  serves  as  a  nuclear  localization  signal  promoting  FOXO  shuttling  from  the  cytoplasm  into  the  nucleus,  which  can  be  antagonized  by  HAUSP  mediated  deubiquitination112.  In  the  Transforming  Growth  Factor  β  (TGFβ)  pathway,  monoubiquitination of the transcription factor Smad4 by the ubiquitin ligase Ectodermin (Ecto) 

22   

inhibits Smad4 interaction with Smad2, preventing formation of an active transcription complex  in the nucleus115. The DUB FAM/USP9x specifically targets Smad4, opposing Ecto and acts as a  positive regulator of TGFβ signalling116.    Our  growing  awareness  of  the  balance  between  E3  ligases  and  DUBs  in  regulating  ubiquitin  modifications has helped redefine the biological role of ubiquitination from a simple one‐way  signal for degradation into a dynamic regulatory system akin to phosphorylation in modulating  protein stability, activity and localization.   

3.5: Disease caused by UPS malfunction  Reflecting  the  fundamental  importance  of  the  UPS  system  in  so  many  different  cellular  processes  for  maintaining  homeostasis,  aberrant  function  of  the  UPS  can  be  associated  to  a  broad  range  of  diseases  including  cancers,  neurological  disorders,  and  autoimmune  diseases.  Cancer  is  one  large  area  of  research;  many  oncogenes  are  transcription  factors  rendered  hyperactive due to loss of UPS regulation. The tumour suppressor p53 (pro‐apoptotic, initiates  DNA  repair,  induces  growth  arrest)  is  normally  down‐regulated  by  the  E3  ligase  MDM2117.  Activating  mutations  in  MDM2  (20%  soft  tissue  cancers,  7%  of  all  cancers118)  leads  to  further  loss  of  p53,  removing  one  major  means  of  tumour  suppression.  The  autosomal  dominant  disorder  Von  Hippel–Lindau  (VHL)  disease  predisposes  affected  individuals  to  a  variety  of  tumors. The VHL gene codes for an E3 ligase that regulates Hypoxia Inducible Factor 1 (HIF1),  the  dysregulation  of  which  leads  to  increased  survival  in  hypoxic  conditions  and  promotes  tumour survival119. FBW7, an F‐box substrate adaptor of the SCF E3 ligase complex, is a strong  23   

tumour suppressor responsible for UPS regulation of several proto‐oncogenes (c‐Myc, Cyclin E,  Jun, Notch), and is mutated in about 6% of primary tumours120. FBW7 ubiquitin ligase activity is  also  countered  by  USP28,  which  deubiquitinates  and  stabilizes  c‐MYC,  and  is  often  highly  expressed in colon and breast carcinomas111. Within the canonical Wnt pathway, disruption of  UPS function by mutations in APC, Axin, and/or β‐catenin can all lead to cancer, especially when  it occurs in stem cell populations like those found in the colon Crypts of Lieberkuhn121.    As  mentioned  briefly  in  previous  sections,  several  prominent  neurological  diseases  such  as  Schizophrenia and Alzheimer’s Disease are associated with altered Wnt signalling. Disrupted in  Schizophrenia  1  (DISC1)  was  the  first  gene  found  highly  associated  with  Schizophrenia,  which  normally acts by inhibiting GSK3‐mediated β‐catenin degradation. Loss of DISC1 function leads  to  increased  β‐catenin  phosphorylation  by  GSK3  and  subsequent  degradation,  damping  canonical  Wnt  signalling  and  loss  of  neuro‐progenitor  cells38.  In  Parkinson’s  disease  (PD),  a  build‐up of α‐synuclein forms pathogenic fibrils that lead to cell death in the brain. α‐synuclein  is normally degraded via ubiquitination by Parkin, an E3 ligase122. Interestingly, the DUB UCH‐L1  has  been  associated  with  susceptibility  to  PD.  UCH‐L1  is  abundant  in  the  brain  (1‐2%  of  total  protein)123,  and  exhibits  both  DUB  and  ligase  activity  depending  on  its  dimerization124.  However, Parkin has been associated with a multitude of other non‐proteolytic ubiquitination  targets125, and there is conflicting evidence regarding whether fibrillized α‐synuclein (deposited  in  Lewy  Bodies  commonly  found  in  distressed  neurons  of  PD  patients) is  protective126,  so  the  precise etiology of PD remains controversial.    

24   

The ubiquitin mediated endocytosis of receptors is also another area of active research, where  dysregulated  ubiquitination/deubiquitination  can  lead  to  increased  receptor  recycling  back  to  the plasma membrane for signalling and may induce activation of auto‐reactive T‐cells that can  lead  to  autoimmune  disease110.  The  activity  of  the  UPS  system  is  thus  often  associated  with  human  diseases.  It  is  therefore  important  to  further  our  knowledge  of  the  normal  cellular  processes regulated by the UPS systems to better understand when it is malfunctioning during  diseases.    

3.6: UPS and Wnt signalling  Aside from regulating β‐catenin stability, recent developments have revealed that other critical  members of the canonical pathway are also subjected to regulation by ubiquitination, and not  only  through  affecting  protein  stability.  The  cytoplasmic  protein  Dvl  is  ubiquitinated  for  degradation by the KLHL12‐Cullin‐3 E3 ligase127, dampening both canonical and non‐canonical  Wnt  signalling.  In  the  absence  of  signalling,  APC  can  also  be  degraded  via  ubiquitination  in  a  process involving Axin. In this case, Wnt pathway activation is thought to inhibit this process,129.  Additionally, APC is also a substrate for K63‐linked ubiquitination that is regulated by the DUB  Trabid, which acts as a positive regulator of signalling130. It is speculated that K63‐ubiquitin may  alter  APC  repressor  activity  within  the  nucleus  in  a  degradation‐independent  manner.  The  Destruction Complex scaffold Axin is also down‐regulated upon Wnt signalling131, presumably in  a ubiquitin dependent manner since Axin C‐terminal sumoylation protects it from degradation  by  preventing  Axin  ubiquitination132.  Interestingly,  the  β‐TrCP  E3  ligase  responsible  for  ubiquitinating β‐catenin also serves an opposite positive role for signalling in the nucleus as a  25   

co‐activator  (along  with  p300)  to  promote  β‐catenin  signalling83.  The  UPS  thus  plays  critical  roles  in  repressing  and  promoting  Wnt  signalling,  yet  the  seemingly  opposing  roles  these  proteins play depending on context suggests that our current understanding of the molecular  mechanisms regulating the canonical pathway is incomplete.   

4.0: Project Goal  The scaffold protein Axin is the central component of the β‐catenin Destruction Complex. How  Axin  functions,  beyond  scaffolding  the  Destruction  Complex  kinases  and  APC  to  catalyze  the  destruction  of  β‐catenin  is  incompletely  understood.  Using  a  proteomic  approach  employing  tandem  affinity  purification  followed  by  Liquid  Chromatography‐Tandem  Mass  Spectrometry  (LC‐MS/MS),  we  identified  Ubiquitin  Specific  Protease  USP34  as  a  novel  Axin‐interacting  protein. Given the central role of the Ubiquitin Proteasome System in regulating Wnt signalling,  the goal of this thesis was to pursue the molecular and functional characterization of the Axin‐ USP34 interaction and study its potential role in the regulation of canonical Wnt signalling.   

26   

5.0: Materials and Methods  5.1: Plasmid Constructs  Human  Axin1  and  Axin2  cDNA  were  cloned  into  the  pGLUE  tandem‐affinity  purification  plasmid127(pGlue‐hAxin1, pGlue‐hAxin2) by PCR from a human brain cDNA library. Human point  mutant  β‐catenin  (pGlue‐pt.mutant‐hβcatenin)  and  human  Dishevelled  2  (pGlue‐hDvl2)  are  described previously133. All PCR amplified regions were sequenced and validated.    

5.2: Tissue Culture and Transfection  Human  HEK293T,  RKO  colon  carcinoma  (ATCC:  CRL‐2577),  SW480  colorectal  adenocarcinoma  (CCL‐228),  HCT116  colorectal  carcinoma  (CCL‐247),  and  Mouse  L  cells  (CRL‐2647/CRL‐2648)  were grown in Dulbecco’s modified Eagle medium (DMEM) supplemented with 10% fetal bovine  serum  (FBS)  and  penicillin/streptomycin  (Sigma‐Aldrich,  St.  Louis,  MO)  in  a  37°C  humidified  incubator with 5% CO2. HEK293T stable cell lines were generated by transfection with calcium  phosphate  followed  by  puromycin  selection  (2μg/ml)  and  maintained  in  culture  with  media  supplemented  with  puromycin.  Transient  cDNA  transfections  were  performed  following  the  manufacturer’s recommendations using Lipofectamine 2000 (Invitrogen, Carlsbad, CA).    For  siRNA  experiments,  cells  were  transfected  with  25nM  of  siRNA  with  recommended  amounts of Lipofectamine RNAiMax (Invitrogen). Previously validated siRNAs against β‐Catenin,  Axin1, Axin2134, and Control‐Non targeting (Dharmacon, Lafayette, CO) were used, while a set  of  4  siRNAs  targeting  USP34  was  tested  by  western  blot  and  the  siRNA  exhibiting  the  most  27   

efficient  knockdown  (USP34  siRNA  A:  5’‐GCAGGGAAGUUCUGACGAAUU‐3’)  was  used  for  all  other experiments.    For the epistasis experiments involving expression of pt.mutant.β‐Catenin or Dvl2 with a given  siRNA,  siRNA  were  first  reverse  transfected  using  RNAiMax  at  the  time  of  seeding  cells,  followed by replacement of media 24h after seeding and cDNA transfectionusing Lipofectamine  2000. Cells were then assayed 36h after cDNA transfection using the TOPFlash reporter assay.   

5.3: Wnt3A Conditioned Media  Mouse  L  Wnt‐3A  cells  (CRL‐2647)  were  cultured  until  reaching  90%  confluence,  upon  which  media  was  collected  and  refreshed  every  two  days  for  a  total  of  6  days.  Collected  media  containing  Wnt3A  was  aliquoted  and  stored  at  4°C.  Media  from  different  days  was  assayed  using TOPFlash assays to determine fractions with maximal activity and subsequently used for  Wnt  stimulation  experiments.  Parental  Mouse  L  cells  not  producing  Wnt3A  (CRL‐2648)  were  also cultured and media similarly collected for use as negative control media.   

5.4: Western Blotting/Antibodies  Proteins  lysates  were  resolved  with  SDS‐polyacrylamide  gels  and  transferred  to  nitrocellulose  membranes.  Blots  were  stained  with  antibodies  indicated  in  the  figure  legends,  then  stained  with 

horseradish 

peroxidase‐conjugated 

secondary 

antibody 

and 

detected 

by 

chemiluminescence. Antibodies: α‐β‐Catenin (#9587, Cell Signalling Technologies); p44/42 MAP 

28   

Kinase  (ERK)  (#9102,  Cell  Signalling  Technologies);  α‐Axin  (C95H11)(#2074,  Cell  Signalling  Technologies);  α‐Acive‐β‐Catenin  (05‐665,  Millipore)  ;  α‐USP34  (A300‐824A,  Bethyl  Labs);  α‐ Lamin  B  (sc‐6217,  Santa  Cruz  Biotechnology);  α‐HA  (MMS‐101P,  Covance);  α‐Flag  (F1804,  Sigma);  peroxidase‐conjugated  secondary  anti‐goat/rabbit/mouse  (705‐035‐147,  711‐035‐152,  715‐035‐150 Jackson ImmunoResearch Laboratories).   

5.5: Tandem‐affinity Purification and Mass Spectrometry  HEK293T  cells  (2×108  cells)  expressing  SBP‐HA‐CBP‐tagged  Axin  construct  were  used  for  the  tandem‐affinity purification procedure as previously described127. Briefly, cells were lysed with  tandem  affinity  purification  lysis  buffer  (TAP  lysis:  10%  glycerol,  50mM  Hepes‐KOH  pH  8.0,  100mM  KCl,  2mM  EDTA,  0.1%  NP40,  2mM  DTT,  10mM  NaF,  0.25mM  Na3VO4,  protease  inhibitors  (Sigma)),  lysates  were  incubated  at  4  °C  with  100μl  packed  streptavidin  resin  (GE  Healthcare).  Resin  beads  were  washed  and  protein  complexes  were  then  eluted  from  the  streptavidin  resin  in  calmodulin  binding  buffer  supplemented  with  2mM  biotin.  The  second  round  of  affinity  purification  was  performed  using  100μl  of  calmodulin  resin  (GE  Healthcare).  Following washes, the protein complexes were eluted with two 100μl elutions with Calmodulin  Elution  Buffer  (50mM  Ammonium  Bicarbonate  pH  8.0,  10mM  EGTA)  and  the  proteins  in  the  complex  were  reduced  in  25mM  dithiothreitol  and  alkylated  using  100mM  iodoacetimide  (Sigma),  and  brought  to  1mM  CaCl2,  then  directly  digested  with  sequenced‐grade  trypsin  (Promega)  overnight  at  37°C.  Following  digestion,  the  sample  was  lyophilized  and  then  resuspended  in  reversed‐phase  HPLC  buffer  A  (0.1%  formic  acid,  5%  acetonitrile,  95%  H2O).  Microcapillary  reversed‐phase  columns  (76‐um  inner  diameter,  361‐um  outer  diameter;  29   

Polymicro  Technology) were  cut  to  a  final  length  of  15–20  cm, and  spray  tips  were  pulled  in‐ house  by  hand.  Columns  were  packed  in‐house  (12  cm)  with  Jupiter  proteo  90‐Å,  4‐um  silica  particles  (Phenomenex)  using  a  pressure  bomb.  Prior  to  loading  the  sample,  columns  were  subjected to a 30  mins equilibration in HPLC buffer B (95% Acetonitrile, 5% H20, 0.1% Formic  Acid) and 30 mins in HPLC buffer A. Half of the trypsin‐digested sample was then applied to the  column  using  a  pressure  bomb.  The  LC  column  was  then  placed  in  front  of  a  LTQ‐XL  mass  spectrometer (Thermo) programmed for data dependent MS/MS acquisition (one survey scan,  five MS/MS of the most abundant ions). After sequencing the same m/z species (+/‐ 3 Da) three  times,  it  was  placed  on  an  exclusion  list  for  3  min.  Peptides  were  eluted  from  the  reversed‐ phase column using a multiphasic elution gradient (5–40% acetonitrile from 0 to 100min, 80%  from  100‐110min,  and  2%  from  110‐120min)  over  a  total  run  duration  of  2  hours.  The  remaining  half  of  the  sample  was  processed  in  the  same  manner.  To  prevent  cross‐ contamination, each sample was analyzed on a freshly prepared reversed‐phase column. Raw  spectra files generated by the instrument software Xcalibur (Finnigan) were searched against a  FASTA  file  containing  the  human  NCBI  sequences  using  a  normalized  implementation  of  SEQUEST. Search parameters were as followed: mass tolerance ± 2 Da; only full tryptic peptides  were retained. Accuracy of the  SEQUEST assignments of MS/MS spectra to peptide sequences  was  estimated  by  the  PeptideProphetTM  software  based  on  a  statistical  model135.  For  each  identified peptide, a probability score  was computed on a scale of 0 (for "incorrect") to 1 (for  "correct") based on match of the peptide sequence to the tandem mass spectra and the trypsin  proteolytic pattern. These assigned peptides  were then subjected to ProteinProphetTM analysis  to assign a protein probability score for each identified protein or related protein group inferred 

30   

from  the  peptide  data136.  The  protein  probabilities,  again  on  a  scale  of  0  to  1,  discriminate  correct (p = 1) from incorrect (p = 0) protein identifications. Validation of initial database search  results  on  the  basis  of  statistical  modeling  allows  the  presentation  of  large‐scale  proteomics  datasets  with  known  sensitivity  for  positive  identifications  and  error  rates  for  false  positive  identifications.    The  SEQUEST  searches  and  the  analysis  using  peptide  and  proteinprophets  were  performed  on  a  Sorcerer  integrated  data  analysis  system  (SageNResearch).    Only  the  proteins  identified  with  a  probability  of  1.00  and  with  at  least  two  independent  peptides  attributed were retained.   

5.6: TOPFlash Luciferase Reporter Assays  Lentiviruses  containing  the  superTOPFlash  β‐catenin  dependent  luciferase  reporter  (Firefly  luciferase) and pRL‐TK (Renilla luciferase) were produced and used to establish stable HEK293T,  RKO, SW480 and HCT116 Wnt‐reporter lines. Cells were seeded on 24‐well plates, followed by  cDNA  transfection  with  Lipofectamine  2000  and/or  reverse  transfection  with  Lipofectamine  RNAiMax  for  siRNA  experiments.  For  experiments  involving  Wnt  stimulation,  media  was  replaced with a 1:1 mix of fresh DMEM:Wnt3A or DMEM:Control conditioned media. Cells were  then  assayed  24h  after  stimulation,  performed  in  accordance  with  the  Dual  Luciferase  assay  specifications (Promega) using a Envision 2103 Multilabel Plate Reader (PerkinElmer).   

31   

5.7: Co‐immunoprecipitation  For  co‐immunoprecipitation  of  endogenous  proteins,  HEK293T  cells  (5x106)  were  lysed  in  tandem  affinity  purification  lysis  buffer  (TAP  lysis:  10%  glycerol,  50mM  Hepes‐KOH  pH  8.0,  100mM  KCl,  2mM  EDTA,  0.1%  NP40,  2mM  DTT,  10mM  NaF,  0.25mM  Na3VO4,  protease  inhibitors  (Sigma)).  Lysates  were  cleared  by  centrifugation  at  16,000g  for  10min  and  immunoprecipitation  was  performed  using  polyclonal  α‐USP34  (Bethyl)  or  polyclonal  α‐Axin1  (#2074,  Cell  Signalling)  antibodies  and  Protein  A  Sepharose  (Sigma).  Immunoprecipitated  protein  complexes  were  then  analyzed  by  western  blot,  using  antibodies  noted  in  figure  legends.   

5.8: K48 Chain Cleavage  1μg of purified K48 chains from Boston Biochem (UC‐230) were incubated in USP Assay Buffer  (20mM Tris pH 8.0, 2mM CaCl2, and 2mM β‐mercaptoethanol) with 20nM USP2 core, 100nM  USP34 core, 1μg of affinity‐purified Axin Complex, or 1μg of Axin Complex (USP34 shRNA). The  samples  were  incubated  at  37ºC  for  30min  and  the  reaction  was  stopped  by  addition  of  SDS  sample buffer. The appearance of mono‐ubiquitin was monitored by western blot using α‐Ub  antibody (Sigma U5379).   

5.9: UBL‐PLA2 Assay  Axin  Activity  Assay:  20nM  USP2  core,  20nM  USP34  core  or  1μg  of  total  protein  from  IPs  was  mixed with 30nM Ub‐PLA2 and 20μM NBD C6HPC (PLA2 substrate, Invitrogen) in a total volume 

32   

of 100μL in a well in a black‐walled 96‐well‐plate (Greiner Bio‐One). Data were collected 45min  after addition of Ub‐PLA2 and NBD C6HPC on Perkin‐Elmer Envision fluorescence plate reader  with excitation and emission filters of 475nm and 555 nm respectively. Net RFU was then used  to calculate signal (isopeptidase or IP + reporter) to background (reporter) ratio. UBL‐selectivity  assays:  Relative  isopeptidase  activity  against  various  UBLPLA2  fusions  was  determined  by  adding the USP34 core to a final concentration of 20nM in combination with 20μM NBD C6‐HPC  and  30nM  of  the  individual  UBL‐PLA2  reporter  constructs  and  expressed  as  a  percentage  of  control isopeptidase: USP2 core (Ub‐PLA2), Senp1core (SUMO3‐PLA2), Den1 (NEDD8‐PLA2), or  PLpro  (ISG15‐PLA2).  The  UBL‐PLA2  assay  reagents  are  available  from  LifeSensors,  Inc.  (www.lifesensors.com) as CHOP reporter kits.   

5.10: Immunofluorescence  Cells were seeded on poly‐D‐lysine treated coverslips and when indicated reverse transfected  with siRNA. 48h after transfection cells were fixed with 4% paraformaldehyde/PBS for 20min,  then permeabilized and blocked with 0.2% Triton X‐100 and 10% normal donkey serum/PBS for  20 mins. Where indicated cells were treated with 5ng/ml Leptomycin B (LC Laboratories, MA)  for  3  hours.  Cells  were  then  stained  by  indirect  immunofluorescence  using  polyclonal  α‐Axin  antibodies  (provided  by  Dr.  Woodget,  Mount  Sinai,  Toronto)  and  Alexa488  conjugated  anti‐ mouse  antibodies.  Cells  were  mounted  with  Vectorshield  (Vector)  and  examined  by  laser  scanning confocal microscope (Zeiss LSM 510).   

33   

5.11: ‐catenin stabilization assay  RKO  cells  were  reverse  transfected  with  siRNA.  48  hours  following  transfection,  cells  were  stimulated  with  control  or  Wnt3A  CM  treatment  for  different  times  (0.5h  –  6h).  Cells  were  washed and lysed with RIPA buffer for 15 mins then cleared by centrifugation at 16,000g for 10  mins  before  being  resuspended  in  SDS  sample  buffer.  ‐catenin  accumulation  was  monitored  by western blot.   

5.12: Axin Ubiquitination  HEK293T  cells  stably  expressing  human  Axin1  (pGlue‐Axin1)  were  transfected  with  Flag‐ Ubiquitin  using  calcium  phosphate.  Cells  were  lysed  48h  after  transfection  using  TAP  lysis  supplemented  or  not  with  20mM  N‐Ethylmaleimide  (Sigma),  cleared  by  centrifugation  at  16,000g  for  10  mins.  Axin  was  then  purified  by  streptavidin  affinity  chromatography  for  1h.  Resin  beads  were  then  washed  three  times  with  lysis  buffer  (also  supplemented  with  NEM  when indicated) and the protein complexes eluted with 2x SDS sample buffer followed by SDS‐ PAGE  electrophoresis  and  western  blotting  using  FLAG  antibodies  to  detect  ubiquitin‐ conjugated Axin proteins.   

5.13: Real‐Time Quantitative‐PCR (RT‐QPCR)  Total  RNA  from  SW480  cells  treated  with  control  or  USP34  siRNAs  were  purified  using  Tri‐ Reagent (Biocompare). After DNaseI (NEB) treatment, RNA was reverse transcribed into cDNA  using the High Capacity cDNA Reverse Transcription kit (Applied Biosystems). Primer sequences  34   

used are: Cyclophilin 5’‐GGAGATGGCACAGGAGGAA‐3’, 5’‐GCCCGTAGTGCTTCAGTTT‐3’; Nkd1 5’‐ TGAGAAGAAGATGGAGAGAGTGAGCGA‐3’,  5’‐GGTGACCTTGCCGTTGTTGTCAAA‐3’;  Tnfrsf19  5’‐  GGAGTTGTCTAAGGAATGTGG‐3’, 5’‐ GCTGAACAATTTGCCTTCTG‐3’. Primer pair efficiencies were  validated as previously described137. Quantitative RT‐PCR analysis was carried out in triplicate  using  an  Applied  Biosystems  Prism  7900HT  instrument.  Each  reaction  contained  12.5ng  of  cDNA,  150nM  of  each  primer,  and  Power  SYBR  green  PCR  Master  Mix  (Applied  Biosystems).  Gene  expression  analysis  was  performed  using  the  comparative  CT  method,  normalized  to  Cyclophilin expression, and fold changes were calculated relative to control siRNA treated cells.    

6.0: Results  6.1: Ubiquitin Specific Protease 34 (USP34) is a novel protein of the Axin  protein complex, identified by mass spectrometry  Axin is a major scaffold protein for anchoring the Destruction Complex members together (APC,  CK1α,  GSK3β)  and  presenting  β‐catenin  for  phosphorylation.  We  set  out  to  explore  the  Axin  protein  complex  with  a  goal  to  identify  and  characterize  novel  proteins  important  for  Axin  function and Wnt signalling. We generated plasmids coding for Axin1 and Axin2 fusion proteins  N‐terminally  tagged  with  streptavidin‐  and  calmodulin‐binding  peptides  along  with  an  HA‐ epitope  (SBP‐HA‐CBP‐Axin1/2),  stably  expressed  these  constructs  in  human  HEK293T  cells,  purified  these  baits  and  associated  proteins  by  tandem  affinity  purification  and  analyzed  the  protein complexes by gel‐free LC‐MS/MS127,133.    35   

Our approach was validated by successful detection of known Axin associated proteins such as  β‐catenin,  APC,  GSK3β,  and  PP2A  (Fig.4A:  green;  Table  2).  Our  method  also  detected  new  proteins  associated  with  Axin  (Fig.4A:  yellow),  and  most  interestingly  the  uncharacterized  protein  USP34  (Fig.4A:  blue)  associated  with  both  Axin1  and  Axin2.  USP34  is  a  large  protein  (3546aa,  ~400  kDa)  with  a  centrally  situated  C19  Peptidase  domain,  characteristic  of  the  USP  family of DUBs138.    The association of USP34 with Axin was verified by co‐immunoprecipitation. Endogenous USP34  was  co‐purified  with  Axin  from  SBP‐HA‐CBP‐Axin  expressing  HEK293T  cell  lysate  using  streptavidin affinity chromatography and subjected to western blot analysis using a polyclonal  USP34 antibody (Fig.4B: lanes 1, 3), while purification of an unrelated expressed protein (HA‐ Radil) did not show an interaction with USP34 (Fig.4B: lanes 2, 4). This suggests that Axin and  USP34 exist in the same protein complex. 

 

 

6.2:  USP34  confers  ubiquitin  specific  protease  activity  to  the  Axin  complex  The association of USP34 with Axin suggests it may confer de‐ubiquitinase (DUB) activity to the  Axin  protein  complex.  To  test  this  hypothesis  we  conducted  ubiquitin  protease  assays  using  purified  Axin  protein  complexes  from  SBP‐HA‐CBP‐Axin  HEK293T  cells.  Recombinant  USP34  core  (catalytic  domain)  and  purified  Axin  complexes  incubated  with  recombinant  K48‐linked  ubiquitin chains produced a distinct mono‐ubiquitin band detectable by western blot, indicative  36   

of  ε‐amino  deubiquitinase  activity  (Fig.5B:  lanes  2,  3).  Recombinant  USP2  was  included  as  positive control (Fig.5B: lane 1). Since depletion of USP34 by stable expression of USP34 shRNA  in  SBP‐HA‐CBP‐Axin  cells  inhibited  the  DUB  activity  associated  with  purified  Axin  complexes,  (Fig.5B: lane 4) we conclude that USP34 is largely responsible for this activity.    We  observed  similar  results  when  employing  the  Ub‐PLA2  assay  as  an  alternative  means  to  quantify  DUB  activity.  The  Ub‐PLA2  consists  of  Ubiquitin  N‐terminally  fused  to  Phospholipase  A2  (PLA2)(α‐amino  linkage),  which  requires  a  free  N‐terminus  to  be  active.  Isopeptidase  catalyzed  cleavage  of  ubiquitin  restores  PLA2  activity  which  can  then  be  measured  by  generation  of  a  fluorophore139.  Recombinant  USP34  core  domain  and  purified  Axin  complex  produced  significantly  more  signal  than  Axin  complex  without  USP34  (USP34  shRNA)  and  purified Radil complex (unrelated protein with no DUB activity)(Fig.5C: lane 2,3 vs. 4,5). shRNA  depletion of endogenous USP34 was demonstrated by western blot (Fig.5A).    The PLA2 assay can also be fused with other ubiquitin‐like proteins such as SUMO, NEDD8, and  ISG15,  and  provides  a  means  of  testing  the  isopeptidase  specificity  of  a  particular  enzyme.  Using these variants of the Ub‐PLA2 assay we determined that the isopeptidase activity of the  recombinant USP34 core is ubiquitin specific (Fig.5D: lane 2 vs. 4, 6, 8).    The  positive  detection  of  DUB  activity  through  the  Ub‐PLA2  assay  (α‐amino  linked  Ub)  and  through  cleavage  of  poly‐ubiquitin  chains  (ε‐linked  Ub)  confirms  USP34  (and  purified  Axin  protein complex) has isopeptidase activity specific for ubiquitin and not other Ubls.. 

37   

 

6.3:  USP34  positively  regulates  ‐catenin  dependent  transcription  downstream of the Destruction Complex  Having established that USP34 is associated with Axin and conferred deubiquitinase activity to  the Axin complex, we proceeded with assessing the functional role of USP34 in the context of  canonical  Wnt  signalling.  RNAi  was  employed  to  knockdown  endogenous  USP34  levels  as  the  large size of USP34 was more amenable to siRNA‐mediated knockdown than to overexpression  since we have been unable to obtain a full length USP34 clone.    We  first  evaluated  the  knockdown  efficiency  of  four  independent  siRNAs  targeting  USP34  mRNA  by  immunoblotting  for  endogenous  USP34.  RKO  cells  were  transfected  with  individual  siRNAs targeting USP34 (Fig.6A: lane 3‐6), a non‐targeting control (Fig.6A: lane 1‐2), and a siRNA  targeting  β‐catenin  (Fig.6A:  lane  7).  Cells  were  lysed  48h  after  transfection  and  analyzed  by  western  blot,  probing  with  anti‐USP34  antibody.  All  four  siRNAs  were  able  to  knockdown  endogenous USP34, and we selected siRNA “A” (Fig.6A: lane 3) for all subsequent experiments  as it consistently yielded the best knockdown.    We then tested the effect of USP34 knockdown on the Wnt response in HEK293T and RKO cell  lines  stably  expressing  the  TOPFlash  β‐catenin  responsive  luciferase  reporter  (Fig.6B).  These  cells  were  transfected  with  a  non‐targeting  siRNA  control,  or  siRNA  targeting  USP34  or  β‐ catenin. 48 hours following transfection they were stimulated with Wnt3a conditioned media 

38   

for 18 hours and the state of pathway activation monitored using the TOPFlash reporter that is  well characterized to report β‐catenin mediated transcriptional activity. At resting state, in the  absence  of  Wnt3a  stimulation,  siRNA  treatments  did  not  elicit  any  TOPFlash  response.  Upon  Wnt3a  stimulation,  both  cell  lines  treated  with  control  siRNA  generated  a  strong  (~30‐fold)  response (Fig.6B: lane 1 vs. 4, 7 vs. 10), which could be strongly reduced by USP34 knockdown  (Fig.6B:  lane  6,  12).  β‐catenin  knockdown  was  included  as  a  positive  control  as  the  reporter  activation  is  dependent  upon  ‐catenin  activity.  Our  TOPFlash  luciferase  reporter  data  thus  suggests that USP34 functions as a positive regulator of canonical Wnt signalling.    The  Wnt  pathway  can  be  artificially  activated  downstream  of  the  ligand‐receptor  complex  by  ectopic  introduction  of  positive  regulators  of  signalling,  such  as  overexpression  of  Dvl2,  or  a  mutant pt.β‐catenin resistant to degradation, and this can be detected by the TOPFlash assay  (ex:  pt.β‐catenin,  Fig.6C:  lane  2‐4).  By  asking  whether  USP34  depletion  could  still  inhibit  the  activation  of  the  pathway  when  activated  at  different  levels  along  the  signalling  cascade  we  could test where in the pathway USP34 was acting. Interestingly, USP34 knockdown was able to  antagonize  the  activation  of  the  pathway  by  both  Dvl2  (data  not  shown)  and  pt.β‐catenin  (Fig.6C: lane 4 vs. 2). These results suggest that USP34 functions downstream of the ‐catenin  stabilization  step.  SW480  and  HCT116  cells  are  colon  cancer  cell  lines  with  constitutive  Wnt  signalling due to inactivating mutation in APC (SW480), and an activating mutation in β‐catenin  (HCT116)  respectively.  We  stably  expressed  the  β‐catenin  responsive  luciferase  reporter  TOPFlash along with a constitutively active Renilla luciferase under EF1α promoter control (for  normalization) in these cells, and then tested the TOPFlash response upon USP34 knockdown  39   

by siRNA. We found that USP34 knockdown can inhibit the constitutively active Wnt pathway in  these  colon  cancer  cells  (Fig.6E:  lane  1  vs.  2,  4  vs.  5)  again  suggesting  that  USP34  functions  downstream  or  at  the  level  of  the  ‐catenin  stabilization  step.  We  further  confirmed  these  findings by showing that USP34 knockdown reduces expression of the endogenous Wnt target  genes Naked1 and Tnfrsf19 (Fig.6F) that are both strongly upregulated by β‐catenin in SW480  colon cancer cells134. These results indicate that USP34 functions as a positive regulator of Wnt  signalling, downstream or at the level of the β‐catenin stabilization step.    To  further  confirm  that  USP34  functions  downstream  of  the  ‐catenin  stabilization  step,  we  measured  the  rate  of  ‐catenin  stabilization  following  Wnt3a  activation  in  RKO  cells  treated  with  control  or  USP34  siRNAs.  RKO  cells  lack  cadherin  junctions  and  thus  exhibit  very  little  membrane bound  β‐catenin  at  resting  state,  simplifying  the  analysis  of  β‐catenin stabilization  induced by Wnt3a stimulation. Treatment with Wnt3a rapidly and robustly stabilizes β‐catenin  in the cytosol of these cells (Fig.6E: control siRNA) over a period of 6 hours and can be detected  by western blot. Pre‐treatment with USP34 siRNA does not alter the kinetics or the magnitude  of  β‐catenin  stabilization  upon  Wnt3a  stimulation  (Fig.6E:  USP34  siRNA).  Endogenous  USP34  was  probed  to  verify  knockdown  and  Lamin‐B  levels  were  measured  as  loading  control.  Together,  these  data  thus  suggests  a  positive  regulatory  role  for  USP34  that  operates  downstream  of  β‐catenin  stabilization.  Since  USP34  is  associated  with  the  Axin  complex  our  next objective was to explore the functional link between these two proteins. 

40   

  6.4:  A  new  positive  regulatory  role  for  Axin  in  the  Wnt  pathway,  downstream of the Destruction Complex  A  recent  study  employing  a  whole  genome  siRNA  screen  probing  for  new  regulators  of  canonical  Wnt  signalling,  found  that  depletion  of  Axin1/Axin2  reduced  β‐catenin  mediated  transcription134.  These  results  were  not  showcased  in  the  original  publication  but  suggest  a  positive regulatory role for Axin in the context of colon cancers, in contrast to its well known  negative regulatory function in signalling. We replicated these results in our SW480 and HCT116  cells (stably expressing the β‐catenin reporter) by testing TOPFLASH response upon Axin1/Axin2  knockdown by siRNA. SW480 and HCT116 colon cancer cell lines harbour mutations in APC and  β‐catenin respectively, and exhibit constitutively active Wnt signalling at resting state140, which  we  have  normalized  to  100%  (Fig.7A:  lanes  1,  4).  This  aberrant  pathway  activity  is  β‐catenin  dependent  as  β‐catenin  knockdown  abolishes  the  TOPFlash  response  (Fig.7A:  lanes  3,  6).  Axin1/Axin2 knockdown reduced TOPFlash to 64% and 30% of baseline (control siRNA) activity  (Fig.7A: lanes 2, 5), confirming the siRNA screen results and suggesting that Axin1 and Axin2 are  required for the constitutive β‐catenin mediated Wnt signalling in colon cancer cells.    As stated previously, this positive role for Axin is completely opposite to its observed and well  characterized negative regulatory role. For example, under resting condition HEK293T and RKO  cells exhibit low basal TOPFlash activity (Fig.7B: lanes 1, 4) and can be stimulated by treatment  with Wnt3A conditioned media (Fig.7B: lanes 2, 5). Pathway activation from Wnt3A treatment  41   

can be potentiated by depleting Axin1/Axin2 (Fig.7B: lanes 3, 6), consistent with the established  negative regulatory role that Axin serves within the Destruction Complex. However, when we  introduced a degradation resistant form of β‐catenin (S37A, loss of GSK3β phosphorylation site)  to constitutively activate the normal pathway in HEK293T cells (mimicking the mutant β‐catenin  responsible  for  aberrant  signalling  in  HCT116  colon  cancer  cells),  Axin  knockdown  once  again  abrogated pathway activation (Fig.7C: lane 4 versus 2).    Since  aberrant  Wnt  signalling  in  SW480  and  HCT116  cells  is  due  to  loss  of  normal  β‐catenin  regulation by the Destruction Complex, our results implied a new function for Axin impinging on  β‐catenin  transcriptional  activity  downstream  or  independently  of  the  Destruction  Complex.  This  prompted  us  to  examine  Axin  subcellular  localization  using  a  polyclonal  Axin1  antibody  using  indirect  Immunofluorescence  in  SW480  and  HCT116  cells.  We  found  strong  nuclear  staining for Axin in these cells, consistent with previous studies141,142, while Axin depletion by  siRNA  eliminated  this  nuclear  labelling  with  some  residual  diffuse  immunostaining,  verifying  Axin antibody specificity (Fig.7D: left panels versus right panels).    In summary, in transformed colon cancer cells exhibiting aberrant Wnt signalling we found that  Axin  is  required  to  maintain  the  constitutive  pathway  activation  and  that  it  was  primarily  localized  in  the  nucleus.  Given  that  USP34  functions  downstream  of  the  destruction  complex  and interacts with Axin, we hypothesized that USP34 could regulate the availability of nuclear  Axin by controlling its stability.   

42   

6.5: USP34 controls the nuclear‐accumulation of Axin  To  assess  whether  USP34  controls  the  steady  state  levels  of  Axin  in  colon  cancer  cells,  we  treated SW480 cells that exhibit strong nuclear Axin labelling with control or USP34 siRNA. We  found  that  USP34  knockdown  almost  completely  abolished  the  immunodetection  of  nuclear  Axin (Fig.8A). This suggests that USP34 is required for Axin nuclear accumulation in colon cancer  cells.    In  cells  with  normal  Wnt  pathway  activation,  Axin  does  not  constitutively  accumulate  in  the  nucleus (Fig.8B: control siRNA without LMB). However, it has been previously shown that Axin  undergoes nuclear‐cytoplasmic shuttling as the nuclear export inhibitor Leptomycin B leads to  its  accumulation  in  the  nucleus72.  We  thus  hypothesized  that  during  Wnt  signalling  USP34  is  required to stabilize the pool of Axin entering/residing in the nucleus. To test this hypothesis,  we examined the effect of USP34 knockdown on the LMB‐induced nuclear Axin localization in  HEK293T  cells.  Agreeing  with  previous  reports,  we  show  that  LMB  can  induce  the  nuclear  accumulation  of  endogenous  Axin  (Fig.8B:  control  siRNA;  immunostaining  verified  by  Axin1  siRNA knockdown). Depletion of USP34 abrogates the Axin nuclear localization. We have also  found  USP34  to  be  mainly  cytoplasmic  in  nuclear/cytoplasmic  fractions  of  different  cell  lines  (data not shown). These findings strongly suggest that the deubiquitinase activity of USP34 is  important  for  Axin  nuclear  localization  not  only  in  cancer  cells  but  in  the  context  of  cells  exhibiting normal Wnt signalling.   

43   

6.6: Axin ubiquitination is dynamic  Earlier studies have indicated that Axin is degraded upon initiation of Wnt signalling143 and this  is dependent on LRP6 activation67,144,145. Our detection of a DUB associated with Axin suggests  that Axin degradation may be mediated by ubiquitination and that USP34 may act within this  context.  We  introduced  FLAG‐tagged  Ubiquitin  (FLAG‐Ub)  by  transfection  into  stable  SBP‐HA‐ CBP‐Axin  expressing  HEK293T  cells  and  48  hours  after  transfection  affinity  purified  Axin  from  cell  lysates  using  streptavidin  chromatography.  We  then  assessed  the  presence  of  ubiquitinated‐Axin  conjugates  by  western  blot  using  FLAG  antibodies.  Under  these  conditions  minimal FLAG‐Ub is present with purified Axin (Fig.9A: top panel lane 1).    However,  since  we  detected  significant  Ubiquitin  protease  activity  in  Axin  complexes  (Fig.5C)  we reasoned that this activity could actively deubiquitinate Axin and hinder our ability to detect  ubiquitinated  forms  of  Axin.  We  initially  attempted  to  circumvent  this  issue  by  depletion  of  endogenous  USP34  via  siRNA  knockdown,  but  this  resulted  in  a  significant  reduction  in  Axin  levels.  While  this  complicated  our  analysis,  destabilization  of  Axin  upon  USP34  knockdown  indirectly implied that Axin is regulated by the ubiquitin proteasome system.    We  next  used  a  sulfhydryl  alkylating  agent,  N‐Ethylmaleimide  (NEM,  non‐specific  cysteine  protease inhibitor), to inhibit all cysteine protease activity (including DUBs) at the time of cell  lysis  to  prevent  Ub‐Axin  from  deubiquitination139.  In  the  presence  of  NEM  we  were  able  to  detect  robust  poly‐ubiquitination  of  Axin  (Fig.9A:  top  panel  lane  2).  In  addition  to  the  high  molecular weight ‘smear’ characteristic of poly‐ubiquitin, distinct bands corresponding to Axin  44   

conjugated  with  a  one,  two,  or  more  ubiquitins  were  detected.  Our  data  demonstrates  that  Axin is mono‐ and poly‐ubiquitinated in HEK293T cells and that USP34 is involved in balancing  this regulation by the UPS.   

6.7: USP34 stabilizes Axin protein levels, likely via deubiquitination and  inhibition of proteasomal mediated degradation.  The loss of nuclear Axin staining in colon cancer cells treated with USP34 siRNA (Fig.8A) could  be  explained  by  two  separate  ubiquitin‐dependent  functions.  Ubiquitination  of  Axin  (possibly  monoubiquitination) could be important to control its subcellular localization in a proteasome  independent  way  or  alternatively  ubiquitination  of  Axin  could  lead  to  its  proteasome‐ dependent degradation. USP34 depletion would in these cases increase Axin ubiquitination and  lead  to  decreased  nuclear  localization  or  increased  proteolysis  respectively.    To  distinguish  between  these  two  possibilities  we  took  advantage  of  the  well  characterized  proteasome  inhibitor MG132 to test whether blocking proteasome functions could rescue the USP34 siRNA  effect (loss of nuclear Axin staining). We pre‐treated SW480 cells with USP34 siRNA, followed  by  an  18h  treatment  with  the  proteasome  inhibitor  MG132  to  block  general  proteasome‐ mediated  degradation.  We  demonstrate  that  MG132  can  rescue  the  loss  of  nuclear  Axin  induced  by  USP34  as  monitored  by  immunofluorescence  (Fig.10A)  and  by  western  blot  (Fig.10B).  We  conclude  that  the  reduction  of  Axin  staining  in  the  nucleus  upon  USP34  knockdown is due to an enhanced degradation of Axin by the UPS system.   

45   

6.8: USP34 as a potential drug target in the Wnt pathway.  We  demonstrated  that  knockdown  of  USP34  activity  strongly  antagonized  the  Wnt  signalling  pathway.  Importantly,  USP34  acts  downstream  of  the  destruction  complex  by  controlling  nuclear Axin  levels.  This  makes  USP34  an  attractive  drug target  as  most  mutations  leading  to  constitutive Wnt pathway activation occur at or downstream of the ‐catenin stabilization step.  We thus hypothesize that a small molecule inhibitor of USP34 would represent a specific Wnt  pathway  inhibitor.  As  a  proof  of  concept  for  this  hypothesis  we  treated  SW480  colon  cancer  cells  with  the  general  cysteine  protease  inhibitor  P5075  and  asked  whether  Axin  levels  and  state  of  constitutive  Wnt  pathway  activation  were  affected.  Incubation  of  SW480  cells  with  increasing  doses  of  P5075  led  to  a  dose  dependent  decrease  in  Axin  protein  levels  (Fig.10C).  When cells were treated with P5075 the TOPFlash reporter was also inhibited by 40%, similar to  cells  treated  with  USP34  siRNA  (Fig.6E).  These  results  suggest  that  inhibition  of  Ubiquitin  protease activity leads to Axin degradation and inhibition of constitutive activity in SW480 cells.   

7.0: Discussion  The requirement of the UPS system for the post‐translational control of ‐catenin stability has  been well characterized56. After identifying a DUB in complex with Axin, a protein critical for the  orchestration  of  ‐catenin  phosphorylation  and  ensuing  ubiquitination,  our  initial  hypothesis  was  that  USP34  counteracts  ‐catenin  ubiquitination.  In  this  context  USP34  would  de‐ ubiquitinate ‐catenin, lead to its stabilization and promote signalling.   

46   

Consistent  with  this  hypothesis,  when  using  the  β‐catenin  responsive  luciferase  reporter  (TOPFLASH)  we  found  that  USP34  knockdown  (by  RNAi)  significantly  attenuated  canonical  pathway  activation  by  Wnt3a  in  HEK293T  and  RKO  cells  that  exhibit  a  normal  canonical  Wnt  pathway. Moreover, USP34 knockdown also reduced the constitutively active signalling found  in SW480 and HCT116 colon cancer cells that have mutations in regulatory components of the  pathway. However, this reduction in pathway response was not due to a decrease in β‐catenin  protein levels, as would be predicted if USP34 controlled ‐catenin stability. Moreover, USP34  knockdown could also inhibit ectopically induced signalling from expression of a constitutively  active β‐catenin that is resistant to ubiquitination. These findings led us to conclude that USP34  exerts a positive role in promoting canonical signalling, but this effect is not mediated through  stabilization of β‐catenin and likely operates downstream of the Destruction Complex.    Interestingly,  using  the  TOPFLASH  functional  assays  we  observed  that  Axin  knockdown  paradoxically reduced the constitutive activity in SW480 and HCT116 colon cancer cells but, as  expected, promoted the Wnt3a stimulation of the pathway in normal HEK293T and RKO cells.  Recent work also indicates that Axin could be playing roles in addition to its well characterized  function  as  a  negative  regulator  of  Wnt  signalling.  Indeed,  a  genome‐wide  integrative  screen  employing RNAi also revealed that Axin was a positive regulator (required for signalling) for β‐ catenin mediated Wnt signalling in colon cancer cells134. Axin has also been repeatedly found in  the nucleus of cancer cells  141 but this has largely been ignored by the field.  Furthermore, Axin  accumulates  in  the  nucleus  of  cells  treated  with  the  CRM1  nuclear  export  inhibitor  LMB72,148  suggesting that it undergoes nuclear cytoplasmic shuttling. These results are in contrast to the  47   

known negative regulation that Axin exerts on canonical Wnt signalling through its role as the  cytoplasmic Destruction Complex scaffold.     One  surprising  finding  of  this  study  is  that  Axin  fulfills  a  positive  regulatory  role  for  Wnt  signalling in addition to its well characterized negative function in the Destruction Complex. We  show that this positive role is masked under normal circumstances due to the dual role of Axin  as a strong negative regulator but is uncovered in the context of colon cancer cells where the  Destruction  Complex  is  inactive  and  ‐catenin  signalling  is  hyperactivated.  The  finding  that  knocking down either Axin or USP34 leads to the inhibition of constitutive ‐catenin activity in  these colon cancer cells suggests that these proteins are needed downstream of the ‐catenin  Destruction  Complex,  possibly  in  the  nucleus.  Mounting  evidence  suggests  multiple  roles  for  other  Wnt  pathway  components.  For  example,  β‐catenin  has  now  been  localized  to  at  least  three distinct subcellular pools to fulfill three disparate processes: adherens junction formation  at the plasma membrane, canonical Wnt signalling in the cytoplasm and the nucleus, and the  regulation of chromosomal integrity when localized to the centrosome149. Dishevelled (Dvl) can  form  a  nuclear  complex  with  c‐jun,  β‐catenin,  and  TCF4  and  this  interaction  is  important  for  canonical Wnt signalling82. Dapper1, a Dvl interacting protein, promotes Dvl degradation in the  cytoplasm,  but  can  also  repress  TCF/LEF  when  in  the  nucleus150.  In  D.  melanogaster  APC  has  been  recently  found  to  have  a  positive  regulatory  role  by  promoting  Axin  downregulation80,  while  nuclear  APC  has  also  been  found  to  promote  CtBP‐mediated  repression  of  canonical  signalling as a form of negative feedback that is absent in colon cancer cells81. In fact APC is a  multifunctional  protein  serving  other  Wnt‐independent  functions  such  as  in  the  regulation  of  48   

cell migration and cell cycle control through its ability to stabilize microtubule ends151,152. Lastly,  the  kinase  GSK3  has  been  found  to  serve  opposing  roles  (in  the  context  of  Wnt  signalling)  depending  on  its  localization  at  the  plasma  membrane,  cytosol,  or  nucleus.  At  the  plasma  membrane, GSK3 has been shown to phosphorylate the Wnt co‐receptor LRP6, a process that is  important  for  signal  amplification  and  transduction68.  Conversely,  Axin‐GSK3  within  the  cytoplasmic Destruction Complex negatively regulates β‐catenin through phosphorylation54. In  the  nucleus,  GSK3  serves  yet  another  negative  regulatory  role  by  modulating  β‐catenin  transcription  in  a  phosphorylation  independent  manner153.  The  diverse  and  sometimes  apparently contradictory functions of these major Wnt pathway components demonstrate the  subtleties  required  for  modulating  pathway  activity,  and  suggest  that  our  observation  of  this  novel positive regulatory role for Axin may in fact be an extension of a general trend for Wnt  pathway components.    The dogma of canonical Wnt signalling has firmly entrenched Axin as a negative regulator of the  pathway through its role as a cytoplasmic scaffold for the function of the ‐catenin Destruction  Complex. The initiation of intracellular signal transduction upon Wnt ligand activation of the Fz‐ LRP6  receptor  complex  leading  to  the  dissolution  of  the  Destruction  Complex  has  been  intensively  studied  in  the  work  discussed  in  the  introduction.  However,  Axin  is  capable  of  entering and leaving the nucleus (facilitated by CRM1 nuclear export72,148), and has been found  concentrated  in  the  nucleus  of  colon  cancer  cells  from  tumour  biopsies141,142.  The  functional  significance  of  nuclear  Axin  and  the  regulatory  mechanisms  controlling  this  localization  have  not been elucidated and these observations need to be reconciled with the established roles of  49   

Axin  within  the  Destruction  Complex.  Consistant  with  these  observations,  we  and  others156  found endogenous Axin to be strongly concentrated in the nucleus of SW480 or HCT116 cells,  (Fig.7D).     The  question  of  how  Axin  exerts  this  positive  role  on  signalling  remains  unresolved.  Does  it  simply  serve  as  an  anchor  to  retain  β‐catenin  in  the  nucleus  or  is  it  required  for  β‐catenin  transcription akin to the nuclear Dvl‐c‐Jun complex82, perhaps by directly interacting with Wnt  target gene promoters? One recent study points to Axin/APC influencing β‐catenin localization  based  on  retention  rather  than  active  transport74.  Surprisingly,  USP34  knockdown  abolished  nuclear Axin staining. Together these results led us to test the hypothesis that USP34 may be  functioning  by  regulating  the  accumulation  of  Axin  in  the  nucleus  where  Axin  may  have  a  second role in canonical Wnt signalling impinging positively on β‐catenin transcription.    Our  working  model  thus  advances  the  involvement  of  USP34  and  the  ubiquitin  proteasome  system in the control of Axin stability. We identified the ubiquitin protease involved in Axin de‐ ubiquitination but our work also implies that an as yet unidentified E3 ubiquitin ligase exists to  control Axin ubiquitination. Furthermore, recent evidence suggests that Axin is sumoylated on  its c‐terminal tail and that this protects it from ubiquitination132. This adds another degree of  complexity  to  unravelling  the  mechanisms  behind  Axin  regulation.  New  experiments  are  now  needed to understand the interplay between USP34 and Axin sumoylation and ubiquitination.   

50   

Since  nuclear  localization  of  Axin  and  β‐catenin  are  important  for  promoting  canonical  Wnt  signalling, especially in maintaining constitutive signalling in colon cancer cells, controlling their  nuclear  residency  by  targeting  USP34  may  provide  a  new  therapeutic  approach  towards  diseases  associated  with  aberrant  Wnt  signalling.  Given  that  the  majority  of  activating  mutations in the pathway occur downstream of the Fz/LRP6 receptor complex (thus strategies  involving  receptor  blockade  would  be  ineffective)  and  the  promiscuous  nature  of  many  core  Wnt components being involved in cross‐talk with other signalling pathways, the development  of compounds specifically inhibiting the Wnt pathway has been largely unsuccessful. However,  small molecules have been isolated and shown to inhibit protein‐protein interactions between  β‐catenin and TCF but have met with challenges regarding the specificity and strength of such  inhibition157.  As  a  result,  currently  there  are  no  drugs  targeting  the  Wnt  pathway  in  clinical  trials.  Some  progress  has  been  made  towards  inhibiting  Wnt  secretion  as  well  as  prolonging  Axin stability158, but in light of our data suggesting a positive role for Axin, this strategy may not  be  as  effective.  The  cysteine  protease  activity  of  USP  enzymes  are  good  targets  for  drug  development,  with  over  ten  cysteine  protease  inhibitors  currently  at  various  stages  of  development  and  clinical  trials159.  USP34  could  therefore  represent  an  alternative  target  for  mitigating  aberrant  Wnt  pathway  activity  through  the  use  of  cysteine  protease  inhibitors,  provided  such  drugs  are  specific  and  exhibit  high  bioavailability  (most  available  cysteine  proteases are of peptide origin)160. Our results with the general USP inhibitor are providing the  proof of principle in that direction.   

51   

In  summary,  this  thesis  demonstrates  nuclear  Axin  serving  a  positive  regulatory  role  in  propagating  canonical  Wnt  signalling.  Through  tandem  affinity  purification  and  mass  spectrometry analysis we found that the deubiquitinase enzyme Ubiquitin Specific Protease 34  (USP34)  is  associated  with  the  Axin  complex.  We  showed  that  USP34  is  responsible  for  the  ubiquitin protease activity present in the Axin complex and through loss of function studies we  demonstrated that USP34 is a positive modulator of β‐catenin transcription acting through the  regulation of Axin stability. We predict that the identification of USP34 inhibitors could be used  for  the  treatment  of  diseases  associated  with  spurious  Wnt  pathway  activation  since  the  reduction  of  function  for  USP34  using  siRNA  or  a  non  specific  small  molecule  inhibitor  led  to  inhibition of constitutive Wnt pathway activity found in colon cancer cells. Future in vivo studies  are  now  needed  to  determine  whether  USP34  inhibition  can  inhibit  or  slow  down  the  development or progression of diseases associated with pathological Wnt signalling.       

 

52   

References  1.

Nusse, R. & Varmus, H.E. Many tumors induced by the mouse mammary tumor virus  contain  a  provirus  integrated  in  the  same  region  of  the  host  genome.  Cell  31,  99‐ 109(1982). 

2.

Kusserow  A,  Pang  K,  Sturm  C,  Hrouda  M,  Lentfer  J,  Schmidt  HA,  Technau  U,  von  Haeseler  A,  Hobmayer  B,  Martindale  MQ  &  Holstein  TW.  Unexpected  complexity  of  the Wnt gene family in a sea anemone. Nature 433, 156‐60(2005). 

3.

Johnston,  L.A.  &  Sanders,  A.L.  Wingless  promotes  cell  survival  but  constrains  growth  during Drosophila wing development. Nat Cell Biol 5, 827‐833(2003). 

4.

McMahon,  A.P.  &  Moon,  R.T.  Ectopic  expression  of  the  proto‐oncogene  int‐1  in  Xenopus embryos leads to duplication of the embryonic axis. Cell 58, 1075‐84(1989). 

5.

Seto, E.S. & Bellen, H.J. The ins and outs of Wingless signaling. Trends Cell Biol 14, 45‐ 53(2004). 

6.

Nichols, S.A., Dirks, W., Pearse, J.S. & King, N. Early evolution of animal cell signaling  and adhesion genes. Proc Natl Acad Sci U S A 103, 12451‐6(2006). 

7.

Ryan,  J.F.  &  Baxevanis,  A.D.  Hox,  Wnt,  and  the  evolution  of  the  primary  body  axis:  insights from the early‐divergent phyla. Biol Direct. 2, 37(2007). 

8.

Dunn,  C.W.,  Hejnol,  A.,  Matus,  D.Q.,  Pang,  K.,  Browne,  W.E.,  Smith,  S.A.,  Seaver,  E.,  Rouse,  G.W.,  Obst,  M.,  Edgecombe,  G.D.,  Sørensen,  M.V.,  Haddock,  S.H.D.,  Schmidt‐ Rhaesa, A., Okusu, A., Kristensen, R.M., Wheeler, W.C., Martindale, M.Q. & Giribet, G.  Broad  phylogenomic  sampling  improves  resolution  of  the  animal  tree  of  life.  Nature  452, 745‐9(2008). 

9.

Wikramanayake, A.H., Hong, M., Lee, P.N., Pang, K., Byrum, C.A., Bince, J.M., Xu, R. &  Martindale,  M.Q.  An  ancient  role  for  nuclear  beta‐catenin  in  the  evolution  of  axial  polarity and germ layer segregation. Nature 426, 446‐50(2003). 

10. Willert, K. & Jones, K.A. Wnt signaling: is the party in the nucleus? Genes Dev 20, 1394‐ 404(2006).  11. De  Calisto,  J.,  Araya,  C.,  Marchant,  L.,  Riaz,  C.F.  &  Mayor,  R.  Essential  role  of  non‐ canonical Wnt signalling in neural crest migration. Development 132, 2587‐97(2005).  12. van  Amerongen,  R.,  Mikels,  A.  &  Nusse,  R.  Alternative  wnt  signaling  is  initiated  by  distinct receptors. Sci Signal 1, re9(2008).  13. Wodarz, A. & Nusse, R. Mechanisms of Wnt signaling in development. Annu Rev Cell  Dev Biol 14, 59‐88(1998).  53   

14. Tao, Q. et al. Maternal wnt11 activates the canonical wnt signaling pathway required  for axis formation in Xenopus embryos. Cell 120, 857‐871(2005).  15. Wu, J., Saint‐Jeannet, J. & Klein, P.S. Wnt‐frizzled signaling in neural crest formation.  Trends Neurosci 26, 40‐45(2003).  16. Sasai, Y. & De Robertis, E.M. Ectodermal patterning in vertebrate embryos. Dev. Biol  182, 5‐20(1997).  17. Radtke, F. & Clevers, H. Self‐renewal and cancer of the gut: two sides of a coin. Science  307, 1904‐9(2005  18. Reya,  T.  &  Clevers,  H.  Wnt  signalling  in  stem  cells  and  cancer.  Nature  434,  843‐ 50(2005).  19. Clevers,  H.  Wnt/beta‐catenin  signaling  in  development  and  disease.  Cell  127,  469‐ 80(2006).  20. Fanto, M. & McNeill, H. Planar polarity from flies to vertebrates. J. Cell. Sci 117, 527‐ 533(2004).   21. Jones,  C.  &  Chen,  P.  Planar  cell  polarity  signaling  in  vertebrates.  Bioessays  29,  120‐ 132(2007).   22. Rohde,  L.A.  &  Heisenberg,  C.  Zebrafish  gastrulation:  cell  movements,  signals,  and  mechanisms. Int. Rev. Cytol 261, 159‐192(2007).   23. Kilian,  B.  et  al.  The  role  of  Ppt/Wnt5  in  regulating  cell  shape  and  movement  during  zebrafish gastrulation. Mech. Dev 120, 467‐476(2003).   24. Seifert, J.R.K. & Mlodzik, M. Frizzled/PCP signalling: a conserved mechanism regulating  cell polarity and directed motility. Nat Rev Genet 8, 126‐38(2007).  25. Torres,  M.A.  et  al.  Activities  of  the  Wnt‐1  class  of  secreted  signaling  factors  are  antagonized  by  the  Wnt‐5A  class  and  by  a  dominant  negative  cadherin  in  early  Xenopus development. J. Cell Biol 133, 1123‐1137(1996).  26. Colorectal  Cancer  statistics.  Canadian  Cancer  Society,  2009.  Accessed  July  10,  2009.  [http://www.cancer.ca/Canada‐wide/About%20cancer/Cancer%20statistics/  Stats%20at%20a%20glance/Colorectal%20cancer.aspx?sc_lang=en]  27. Korinek, V. et al. Constitutive transcriptional activation by a beta‐catenin‐Tcf complex  in APC‐/‐ colon carcinoma. Science 275, 1784‐1787(1997).   28. Nishisho, I. et al. Mutations of chromosome 5q21 genes in FAP and colorectal cancer  patients. Science 253, 665‐669(1991).   54   

29. Miyoshi,  Y.  et  al.  Somatic  mutations  of  the  APC  gene  in  colorectal  tumors:  mutation  cluster region in the APC gene. Hum. Mol. Genet 1, 229‐233(1992).  30. Barker,  N.  &  Clevers,  H.  Mining  the  Wnt  pathway  for  cancer  therapeutics.  Nat  Rev  Drug Discov 5, 997‐1014(2006).  31. Zucman‐Rossi,  J.  et  al.  Differential  effects  of  inactivated  Axin1  and  activated  beta‐ catenin mutations in human hepatocellular carcinomas. Oncogene 26, 774‐780(2007).  32. Deshpande, A.J. & Buske, C. Knocking the Wnt out of the sails of leukemia stem cell  development. Cell Stem Cell 1, 597‐8(2007).  33. Van  Scoyk,  M.,  Randall,  J.,  Sergew,  A.,  Williams,  L.M.,  Tennis,  M.  &  Winn,  R.A.  Wnt  signaling pathway and lung disease. Transl Res 151, 175‐80(2008).  34. Callahan,  R.  &  Smith,  G.H.  MMTV‐induced  mammary  tumorigenesis:  gene  discovery,  progression to malignancy and cellular pathways. Oncogene 19, 992‐1001(2000).   35. Legoix,  P.  et  al.  Beta‐catenin  mutations  in  hepatocellular  carcinoma  correlate  with  a  low rate of loss of heterozygosity. Oncogene 18, 4044‐4046(1999).   36. Laurent‐Puig,  P.  et  al.  Genetic  alterations  associated  with  hepatocellular  carcinomas  define  distinct  pathways  of  hepatocarcinogenesis.  Gastroenterology  120,  1763‐ 1773(2001).   37. Ross, C.A. et al. Neurobiology of schizophrenia. Neuron 52, 139‐153(2006).  38. Mao, Y. et al. Disrupted in schizophrenia 1 regulates neuronal progenitor proliferation  via modulation of GSK3beta/beta‐catenin signaling. Cell 136, 1017‐1031(2009).   39. De  Ferrari,  G.V.  &  Moon,  R.T.  The  ups  and  downs  of  Wnt  signaling  in  prevalent  neurological disorders. Oncogene 25, 7545‐7553(0).  40. Inestrosa, N.C. et al. Synaptotoxicity in Alzheimer's disease: the Wnt signaling pathway  as a molecular target. IUBMB Life 59, 316‐321(2007).   41. De  Ferrari,  G.V.  et  al.  Activation  of  Wnt  signaling  rescues  neurodegeneration  and  behavioral  impairments  induced  by  beta‐amyloid  fibrils.  Mol.  Psychiatry  8,  195‐ 208(2003).  42. Warden,  S.M.,  Andreoli,  C.M.  &  Mukai,  S.  The  Wnt  signaling  pathway  in  familial  exudative vitreoretinopathy and Norrie disease. Semin Ophthalmol 22, 211‐217(2007).   43. Hausmann,  G.,  Bänziger,  C.  &  Basler,  K.  Helping  Wingless  take  flight:  how  WNT  proteins are secreted. Nat Rev Mol Cell Biol 8, 331‐6(2007). 

55   

44. Logan, C.Y. & Nusse, R. The Wnt signaling pathway in development and disease. Annu  Rev Cell Dev Biol 20, 781‐810(2004).   45. Panáková,  D.,  Sprong,  H.,  Marois,  E.,  Thiele,  C.  &  Eaton,  S.  Lipoprotein  particles  are  required for Hedgehog and Wingless signalling. Nature 435, 58‐65(2005).  46. Port,  F.,  Kuster,  M.,  Herr,  P.,  Furger,  E.,  Bänziger,  C.,  Hausmann,  G.  &  Basler,  K.  Wingless  secretion  promotes  and  requires  retromer‐dependent  cycling  of  Wntless.  Nat Cell Biol 10, 178‐85(2008).   47. Eaton, S. Retromer retrieves wntless. Dev Cell 14, 4‐6(2008).  48. Coudreuse, D.Y.M., Roël, G., Betist, M.C., Destrée, O. & Korswagen, H.C. Wnt gradient  formation  requires  retromer  function  in  Wnt‐producing  cells.  Science  312,  921‐ 4(2006).  49. Jamora, C. & Fuchs, E. Intercellular adhesion, signalling and the cytoskeleton. Nat. Cell  Biol 4, E101‐108(2002).   50. Bek, S. & Kemler, R. Protein kinase CKII regulates the interaction of beta‐catenin with  alpha‐catenin and its protein stability. J. Cell. Sci 115, 4743‐4753(2002).  51. Nelson, W.J. & Nusse, R. Convergence of Wnt, beta‐catenin, and cadherin pathways.  Science 303, 1483‐1487(2004).   52. Korswagen,  H.C.,  Herman,  M.A.  &  Clevers,  H.C.  Distinct  beta‐catenins  mediate  adhesion and signalling functions in C. elegans. Nature 406, 527‐532(2000).  53. Amit,  S.  et  al.  Axin‐mediated  CKI  phosphorylation  of  beta‐catenin  at  Ser  45:  a  molecular switch for the Wnt pathway. Genes Dev 16, 1066‐1076(2002).  54. Liu,  C.,  Li,  Y.,  Semenov,  M.,  Han,  C.,  Baeg,  G.H.,  Tan,  Y.,  Zhang,  Z.,  Lin,  X.  &  He,  X.  Control  of  beta‐catenin  phosphorylation/degradation  by  a  dual‐kinase  mechanism.  Cell 108, 837‐847(2002).   55. Su, Y., Fu, C., Ishikawa, S., Stella, A., Kojima, M., Shitoh, K., Schreiber, E.M., Day, B.W.  &  Liu,  B.  APC  is  essential  for  targeting  phosphorylated  beta‐catenin  to  the  SCFbeta‐ TrCP ubiquitin ligase. Mol. Cell 32, 652‐661(2008).   56. Liu,  C.,  Kato,  Y.,  Zhang,  Z.,  Do,  V.M.,  Yankner,  B.A.  &  He,  X.  beta‐Trcp  couples  beta‐ catenin  phosphorylation‐degradation  and  regulates  Xenopus  axis  formation.  Proc.  Natl. Acad. Sci. U.S.A 96, 6273‐6278(1999).   57. Bhanot, P. et al. A new member of the frizzled family from Drosophila functions as a  Wingless receptor. Nature 382, 225‐230(1996). 

56   

58. Yang‐Snyder,  J.  et  al.  A  frizzled  homolog  functions  in  a  vertebrate  Wnt  signaling  pathway. Curr. Biol 6, 1302‐1306(1996).  59. Schulte,  G.  &  Bryja,  V.  The  Frizzled  family  of  unconventional  G‐protein‐coupled  receptors. Trends Pharmacol. Sci 28, 518‐525(2007).   60. Liu, G., Bafico, A. & Aaronson, S.A. The mechanism of endogenous receptor activation  functionally distinguishes prototype canonical and noncanonical Wnts. Mol. Cell. Biol  25, 3475‐3482(2005).   61. Harris, K.E. & Beckendorf, S.K. Different Wnt signals act through the Frizzled and RYK  receptors  during  Drosophila  salivary  gland  migration.  Development  134,  2017‐ 2025(2007).  62. Lyu, J., Yamamoto, V. & Lu, W. Cleavage of the Wnt receptor Ryk regulates neuronal  differentiation during cortical neurogenesis. Dev. Cell 15, 773‐780(2008).  63. Oishi,  I.  et  al.  The  receptor  tyrosine  kinase  Ror2  is  involved  in  non‐canonical  Wnt5a/JNK signalling pathway. Genes Cells 8, 645‐654(2003).  64. Mikels, A.J. & Nusse, R. Purified Wnt5a protein activates or inhibits beta‐catenin‐TCF  signaling depending on receptor context. PLoS Biol 4, e115(2006).  65. Xu, Q. et al. Vascular development in the retina and inner ear: control by Norrin and  Frizzled‐4, a high‐affinity ligand‐receptor pair. Cell 116, 883‐895(2004).   66. Mao, B. et al. Kremen proteins are Dickkopf receptors that regulate Wnt/beta‐catenin  signalling. Nature 417, 664‐667(2002).   67. Tolwinski, N.S., Wehrli, M., Rives, A., Erdeniz, N., DiNardo, S. & Wieschaus, E. Wg/Wnt  signal  can  be  transmitted  through  arrow/LRP5,6  and  Axin  independently  of  Zw3/Gsk3beta activity. Dev. Cell 4, 407‐418(2003).  68. Zeng, X., Huang, H., Tamai, K., Zhang, X., Harada, Y., Yokota, C., Almeida, K., Wang, J.,  Doble,  B.,  Woodgett,  J.,  Wynshaw‐Boris,  A.,  Hsieh,  J.  &  He,  X.  Initiation  of  Wnt  signaling:  control  of  Wnt  coreceptor  Lrp6  phosphorylation/activation  via  frizzled,  dishevelled and axin functions. Development 135, 367‐75(2008).  69. Fagotto,  F.,  Glück,  U.  &  Gumbiner,  B.M.  Nuclear  localization  signal‐independent  and  importin/karyopherin‐independent  nuclear  import  of  beta‐catenin.  Curr.  Biol  8,  181‐ 190(1998).   70. Wu,  X.,  Tu,  X.,  Joeng,  K.S.,  Hilton,  M.J.,  Williams,  D.A.  &  Long,  F.  Rac1  activation  controls nuclear localization of beta‐catenin during canonical Wnt signaling. Cell 133,  340‐353(2008). 

57   

71. Sayat, R. et al. O‐GlcNAc‐glycosylation of beta‐catenin regulates its nuclear localization  and transcriptional activity. Exp. Cell Res 314, 2774‐2787(2008).   72. Cong,  F.  &  Varmus,  H.  Nuclear‐cytoplasmic  shuttling  of  Axin  regulates  subcellular  localization of beta‐catenin. Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A 101, 2882‐2887(2004).   73. Henderson,  B.R.  Nuclear‐cytoplasmic  shuttling  of  APC  regulates  beta‐catenin  subcellular localization and turnover. Nat. Cell Biol 2, 653‐660(2000).  74. Krieghoff, E., Behrens, J. & Mayr, B. Nucleo‐cytoplasmic distribution of beta‐catenin is  regulated by retention. J. Cell. Sci 119, 1453‐1463(2006).   75. van  Noort,  M.,  Meeldijk,  J.,  van  der  Zee,  R.,  Destree,  O.  &  Clevers,  H.  Wnt  signaling  controls  the  phosphorylation  status  of  beta‐catenin.  J.  Biol.  Chem  277,  17901‐ 17905(2002).   76. Staal, F.J.T., Noort Mv, M.V., Strous, G.J. & Clevers, H.C. Wnt signals are transmitted  through N‐terminally dephosphorylated beta‐catenin. EMBO Rep 3, 63‐68(2002).   77. Hendriksen, J., Jansen, M., Brown, C.M., van der Velde, H., van Ham, M., Galjart, N.,  Offerhaus,  G.J.,  Fagotto,  F.  &  Fornerod,  M.  Plasma  membrane  recruitment  of  dephosphorylated  beta‐catenin  upon  activation  of  the  Wnt  pathway.  J.  Cell.  Sci  121,  1793‐1802(2008).   78. Daniels, D.L. & Weis, W.I. Beta‐catenin directly displaces Groucho/TLE repressors from  Tcf/Lef  in  Wnt‐mediated  transcription  activation.  Nat.  Struct.  Mol.  Biol  12,  364‐ 371(2005).   79. Tang,  W.,  Dodge,  M.,  Gundapaneni,  D.,  Michnoff,  C.,  Roth,  M.  &  Lum,  L.  A  genome‐ wide  RNAi  screen  for  Wnt/beta‐catenin  pathway  components  identifies  unexpected  roles  for  TCF  transcription  factors  in  cancer.  Proc.  Natl.  Acad.  Sci.  U.S.A  105,  9697‐ 9702(2008).  80. Takacs, C.M., Baird, J.R., Hughes, E.G., Kent, S.S., Benchabane, H., Paik, R. & Ahmed, Y.  Dual positive and negative regulation of wingless signaling by adenomatous polyposis  coli. Science 319, 333‐336(2008).  81. Sierra,  J.,  Yoshida,  T.,  Joazeiro,  C.A.  &  Jones,  K.A.  The  APC  tumor  suppressor  counteracts beta‐catenin activation and H3K4 methylation at Wnt target genes. Genes  Dev 20, 586‐600(2006).   82. Gan, X., Wang, J., Xi, Y., Wu, Z., Li, Y. & Li, L. Nuclear Dvl, c‐Jun, beta‐catenin, and TCF  form a complex leading to stabilization of beta‐catenin‐TCF interaction. J. Cell Biol 180,  1087‐1100(2008). 

58   

83. Kimbrel, E.A. & Kung, A.L. The F‐box Protein {beta}‐TrCp1/Fbw1a Interacts with p300  to  Enhance  {beta}‐Catenin  Transcriptional  Activity.  J.  Biol.  Chem  284,  13033‐ 13044(2009).  84. Ciechanover,  A.  Intracellular  Protein  Degradation:  From  a  Vague  Idea  thru  the  Lysosome and the Ubiquitin‐Proteasome System and onto Human Diseases and Drug  Targeting.  Nobel  Lecture,  the  Nobel  Prize  in  Chemistry  (2004).  [http://nobelprize.org/nobel_prizes/chemistry/laureates/2004/ciechanover‐ lecture.html]  85. Lee, D.H. & Goldberg, A.L. Proteasome inhibitors: valuable new tools for cell biologists.  Trends Cell Biol 8, 397‐403(1998).   86. Goldstein, A.L., Slater, F.D. & White, A. Preparation, assay, and partial purification of a  thymic  lymphocytopoietic  factor  (thymosin).  Proc  Natl  Acad  Sci  U  S  A  56,  1010‐ 7(1966).  87. Goldknopf,  I.L.  &  Busch,  H.  Isopeptide  linkage  between  nonhistone  and  histone  2A  polypeptides of chromosomal conjugate‐protein A24. Proc Natl Acad Sci U S A 74, 864‐ 8(1977).  88. Sun, Z. & Allis, C.D. Ubiquitination of histone H2B regulates H3 methylation and gene  silencing in yeast. Nature 418, 104‐8(2002).  89. Glickman,  M.H.  &  Ciechanover,  A.  The  ubiquitin‐proteasome  proteolytic  pathway:  destruction for the sake of construction. Physiol Rev 82, 373‐428(2002).  90. Pickart,  C.M.  &  Eddins,  M.J.  Ubiquitin:  structures,  functions,  mechanisms.  Biochim  Biophys Acta 1695, 55‐72(2004).  91. Wong,  B.R.,  Parlati,  F.,  Qu,  K.,  Demo,  S.,  Pray,  T.,  Huang,  J.,  Payan,  D.G.  &  Bennett,  M.K.  Drug  discovery  in  the  ubiquitin  regulatory  pathway.  Drug  Discov  Today  8,  746‐ 54(2003).  92. Li,  W.  et  al.  Genome‐wide  and  functional  annotation  of  human  E3  ubiquitin  ligases  identifies  MULAN,  a  mitochondrial  E3  that  regulates  the  organelle's  dynamics  and  signaling. PLoS ONE 3, e1487(2008).  93. Wu, G., Xu, G., Schulman, B.A., Jeffrey, P.D., Harper, J.W. & Pavletich, N.P. Structure of  a  beta‐TrCP1‐Skp1‐beta‐catenin  complex:  destruction  motif  binding  and  lysine  specificity of the SCF(beta‐TrCP1) ubiquitin ligase. Mol. Cell 11, 1445‐1456(2003).  94. Sun,  L.  &  Chen,  Z.J.  The  novel  functions  of  ubiquitination  in  signaling.  Curr  Opin  Cell  Biol 16, 119‐26(2004).   95. Johnson, E.S. Ubiquitin branches out. Nat Cell Biol 4, E295‐8(2002).   59   

96. Hicke, L. A new ticket for entry into budding vesicles‐ubiquitin. Cell 106, 527‐30(2001).  97. Haracska,  L.,  Torres‐Ramos,  C.A.,  Johnson,  R.E.,  Prakash,  S.  &  Prakash,  L.  Opposing  effects  of  ubiquitin  conjugation  and  SUMO  modification  of  PCNA  on  replicational  bypass of DNA lesions in Saccharomyces cerevisiae. Mol Cell Biol 24, 4267‐74(2004).  98. Hoege,  C.,  Pfander,  B.,  Moldovan,  G.,  Pyrowolakis,  G.  &  Jentsch,  S.  RAD6‐dependent  DNA repair is linked to modification of PCNA by ubiquitin and SUMO. Nature 419, 135‐ 141(2002).  99. Varadan,  R.,  Assfalg,  M.,  Haririnia,  A.,  Raasi,  S.,  Pickart,  C.  &  Fushman,  D.  Solution  conformation of Lys63‐linked di‐ubiquitin chain provides clues to functional diversity  of polyubiquitin signaling. J. Biol. Chem 279, 7055‐7063(2004).  100. Prakash,  S.,  Tian,  L.,  Ratliff,  K.S.,  Lehotzky,  R.E.  &  Matouschek,  A.  An  unstructured  initiation site is required for efficient proteasome‐mediated degradation. Nat. Struct.  Mol. Biol 11, 830‐837(2004).   101. Prakash,  S.,  Inobe,  T.,  Hatch,  A.J.  &  Matouschek,  A.  Substrate  selection  by  the  proteasome during degradation of protein complexes. Nat. Chem. Biol 5, 29‐36(2009).  102. Schubert, U., Antón, L.C., Gibbs, J., Norbury, C.C., Yewdell, J.W. & Bennink, J.R. Rapid  degradation of a large fraction of newly synthesized proteins by proteasomes. Nature  404, 770‐774(2000).   103. Kölling,  R.  &  Hollenberg,  C.P.  The  ABC‐transporter  Ste6  accumulates  in  the  plasma  membrane  in  a  ubiquitinated  form  in  endocytosis  mutants.  EMBO  J  13,  3261‐ 3271(1994).  104. Kostova,  Z.  &  Wolf,  D.H.  For  whom  the  bell  tolls:  protein  quality  control  of  the  endoplasmic  reticulum  and  the  ubiquitin‐proteasome  connection.  EMBO  J  22,  2309‐ 2317(2003).  105. Ciechanover, A. & Brundin, P. The ubiquitin proteasome system in neurodegenerative  diseases: sometimes the chicken, sometimes the egg. Neuron 40, 427‐446(2003).  106. von  Mikecz,  A.  The  nuclear  ubiquitin‐proteasome  system.  J.  Cell.  Sci  119,  1977‐ 1984(2006).   107. Nijman,  S.M.B.,  Luna‐Vargas,  M.P.A.,  Velds,  A.,  Brummelkamp,  T.R.,  Dirac,  A.M.G.,  Sixma,  T.K.  &  Bernards,  R.  A  genomic  and  functional  inventory  of  deubiquitinating  enzymes. Cell 123, 773‐786(2005).   108. Kattenhorn,  L.M.,  Korbel,  G.A.,  Kessler,  B.M.,  Spooner,  E.  &  Ploegh,  H.L.  A  deubiquitinating enzyme encoded by HSV‐1 belongs to a family of cysteine proteases  that is conserved across the family Herpesviridae. Mol. Cell 19, 547‐557(2005).   60   

109. Henry, K.W. et al. Transcriptional activation via sequential histone H2B ubiquitylation  and  deubiquitylation,  mediated  by  SAGA‐associated  Ubp8.  Genes  Dev  17,  2648‐ 2663(2003).   110. Duan, L. et al. The Cbl family and other ubiquitin ligases: destructive forces in control  of antigen receptor signaling. Immunity 21, 7‐17(2004).   111. Popov, N., Wanzel, M., Madiredjo, M., Zhang, D., Beijersbergen, R., Bernards, R., Moll,  R., Elledge, S.J. & Eilers, M. The ubiquitin‐specific protease USP28 is required for MYC  stability. Nat. Cell Biol 9, 765‐774(2007).   112. van der Horst, A., de Vries‐Smits, A.M.M., Brenkman, A.B., van Triest, M.H., van den  Broek,  N.,  Colland,  F.,  Maurice,  M.M.  &  Burgering,  B.M.T.  FOXO4  transcriptional  activity  is  regulated  by  monoubiquitination  and  USP7/HAUSP.  Nat.  Cell  Biol  8,  1064‐ 1073(2006).  113. Gesbert,  F.,  Malardé,  V.  &  Dautry‐Varsat,  A.  Ubiquitination  of  the  common  cytokine  receptor gammac and regulation of expression by an ubiquitination/deubiquitination  machinery. Biochem. Biophys. Res. Commun 334, 474‐480(2005).   114. Brooks,  C.L.,  Li,  M.,  Hu,  M.,  Shi,  Y.  &  Gu,  W.  The  p53‐‐Mdm2‐‐HAUSP  complex  is  involved in p53 stabilization by HAUSP. Oncogene 26, 7262‐7266(2007).  115. Schmierer, B. & Hill, C.S. TGFbeta‐SMAD signal transduction: molecular specificity and  functional flexibility. Nat. Rev. Mol. Cell Biol 8, 970‐982(2007).   116. Dupont,  S.  et  al.  FAM/USP9x,  a  deubiquitinating  enzyme  essential  for  TGFbeta  signaling, controls Smad4 monoubiquitination. Cell 136, 123‐135(2009).   117. Michael,  D.  &  Oren,  M.  The  p53‐Mdm2  module  and  the  ubiquitin  system.  Semin.  Cancer Biol 13, 49‐58(2003)  118. Momand, J. et al. The MDM2 gene amplification database. Nucleic Acids Res 26, 3453‐ 3459(1998).   119. Li, Z. et al. Identification of a deubiquitinating enzyme subfamily as substrates of the  von  Hippel‐Lindau  tumor  suppressor.  Biochem.  Biophys.  Res.  Commun  294,  700‐ 709(2002).   120. Welcker,  M.  &  Clurman,  B.E.  FBW7  ubiquitin  ligase:  a  tumour  suppressor  at  the  crossroads of cell division, growth and differentiation. Nat. Rev. Cancer 8, 83‐93(2008).  121. Barker, N. et al. Crypt stem cells as the cells‐of‐origin of intestinal cancer. Nature 457,  608‐611(2009). 

61   

122. Lansbury, P.T. & Brice, A. Genetics of Parkinson's disease and biochemical studies of  implicated gene products. Curr. Opin. Genet. Dev 12, 299‐306(2002).   123. Wilkinson,  K.D.  et  al.  The  neuron‐specific  protein  PGP  9.5  is  a  ubiquitin  carboxyl‐ terminal hydrolase. Science 246, 670‐673(1989).   124. Liu,  Y.  et  al.  The  UCH‐L1  gene  encodes  two  opposing  enzymatic  activities  that  affect  alpha‐synuclein  degradation  and  Parkinson's  disease  susceptibility.  Cell  111,  209‐ 218(2002).   125. Feany, M.B. & Pallanck, L.J. Parkin: a multipurpose neuroprotective agent? Neuron 38,  13‐16(2003).   126. Goldberg,  M.S.  &  Lansbury,  P.T.  Is  there  a  cause‐and‐effect  relationship  between  alpha‐synuclein fibrillization and Parkinson's disease? Nat. Cell Biol 2, E115‐119(2000).   127. Angers, S., Thorpe, C.J., Biechele, T.L., Goldenberg, S.J., Zheng, N., MacCoss, M.J. and  Moon, R.T. (2006b) The KLHL12‐Cullin‐3 ubiquitin ligase negatively regulates the Wnt‐ beta‐catenin pathway by targeting Dishevelled for degradation. Nat Cell Biol, 8, 348‐ 357.  128. Simons,  M.  et  al.  Inversin,  the  gene  product  mutated  in  nephronophthisis  type  II,  functions as a molecular switch between Wnt signaling pathways. Nat. Genet 37, 537‐ 543(2005).   129. Choi,  J.  et  al.  Adenomatous  polyposis  coli  is  down‐regulated  by  the  ubiquitin‐ proteasome  pathway  in  a  process  facilitated  by  Axin.  J.  Biol.  Chem  279,  49188‐ 49198(2004).   130. Tran, H., Hamada, F., Schwarz‐Romond, T. & Bienz, M. Trabid, a new positive regulator  of  Wnt‐induced  transcription  with  preference  for  binding  and  cleaving  K63‐linked  ubiquitin chains. Genes Dev 22, 528‐542(2008).   131. Yamamoto,  H.  et  al.  Phosphorylation  of  axin,  a  Wnt  signal  negative  regulator,  by  glycogen  synthase  kinase‐3beta  regulates  its  stability.  J.  Biol.  Chem  274,  10681‐ 10684(1999).   132. Kim, M.J., Chia, I.V. & Costantini, F. SUMOylation target sites at the C terminus protect  Axin from ubiquitination and confer protein stability. FASEB J 22, 3785‐3794(2008).   133. Angers,  S.,  Li,  T.,  Yi,  X.,  MacCoss,  M.J.,  Moon,  R.T.  and  Zheng,  N.  (2006a)  Molecular  architecture  and  assembly  of  the  DDB1‐CUL4A  ubiquitin  ligase  machinery.  Nature,  443, 590‐593.  134. Major, M.B., Roberts, B.S., Berndt, J.D., Marine, S., Anastas, J., Chung, N., Ferrer, M.,  Yi, X., Stoick‐Cooper, C.L., von Haller, P.D., Kategaya, L., Chien, A., Angers, S., MacCoss,  62   

M.,  Cleary,  M.A.,  Arthur,  W.T.  &  Moon,  R.T.  New  regulators  of  Wnt/beta‐catenin  signaling revealed by integrative molecular screening. Sci Signal 1, ra12(2008).  135. Keller,  A.,  Nesvizhskii,  A.  I.,  Kolker,  E.,  and  Aebersold,  R.  (2002)  Empirical  statistical  model  to  estimate  the  accuracy  of  peptide  identifications  made  by  MS/MS  and  database search. Anal. Chem. 74, 5383 –5392).  136. Nesvizhskii, A. I., Keller, A., Kolker, E., and Aebersold, R. (2003) A statistical model for  identifying  proteins  by  tandem  mass  spectrometry.  Establishment,  characterization,  and long‐term maintenance of cultures of human fetal hepatocytes. Anal. Chem. 75,  4646 –4658).  137. Bookout, A.L. et al. High‐throughput real‐time quantitative reverse transcription PCR.  Curr Protoc Mol Biol Chapter 15, Unit 15.8(2006).   138. Quesada,  V.,  Díaz‐Perales,  A.,  Gutiérrez‐Fernández,  A.,  Garabaya,  C.,  Cal,  S.  &  López‐ Otín,  C.  Cloning  and  enzymatic  analysis  of  22  novel  human  ubiquitin‐specific  proteases. Biochem Biophys Res Commun 314, 54‐62(2004).  139. Nicholson,  B.  et  al.  Characterization  of  ubiquitin  and  ubiquitin‐like‐protein  isopeptidase activities. Protein Sci 17, 1035‐1043(2008).   140. Thompson, B., Townsley, F., Rosin‐Arbesfeld, R., Musisi, H. & Bienz, M. A new nuclear  component of the Wnt signalling pathway. Nat Cell Biol 4, 367‐73(2002).  141. Anderson,  C.B.,  Neufeld,  K.L.  &  White,  R.L.  Subcellular  distribution  of  Wnt  pathway  proteins in normal and neoplastic colon. Proc Natl Acad Sci U S A 99, 8683‐8(2002).  142. Salahshor, S. & Woodgett, J.R. The links between axin and carcinogenesis. J Clin Pathol  58, 225‐36(2005).   143. Willert, K., Shibamoto, S. & Nusse, R. Wnt‐induced dephosphorylation of axin releases  beta‐catenin from the axin complex. Genes Dev 13, 1768‐1773(1999).   144. Kofron, M. et al. Wnt11/beta‐catenin signaling in both oocytes and early embryos acts  through LRP6‐mediated regulation of axin. Development 134, 503‐13(2007).   145. Mao,  J.  et  al.  Low‐density  lipoprotein  receptor‐related  protein‐5  binds  to  Axin  and  regulates the canonical Wnt signaling pathway. Mol. Cell 7, 801‐809(2001).   146. Lee,  E.  et  al.  The  roles  of  APC  and  Axin  derived  from  experimental  and  theoretical  analysis of the Wnt pathway. PLoS Biol 1, E10(2003).  147. Faux, M.C. et al. Recruitment of adenomatous polyposis coli and beta‐catenin to axin‐ puncta. Oncogene 27, 5808‐5820(2008).  

63   

148. Wiechens,  N.  et  al.  Nucleo‐cytoplasmic  shuttling  of  Axin,  a  negative  regulator  of  the  Wnt‐beta‐catenin Pathway. J Biol Chem 279, 5263‐7(2004).   149. Bahmanyar,  S.  et  al.  beta‐Catenin  is  a  Nek2  substrate  involved  in  centrosome  separation. Genes Dev 22, 91‐105(2008).   150. Gao,  X.  et  al.  Dapper1  is  a  nucleocytoplasmic  shuttling  protein  that  negatively  modulates Wnt signaling in the nucleus. J. Biol. Chem 283, 35679‐35688(2008).  151. Aoki, K. & Taketo, M.M. Adenomatous polyposis coli (APC): a multi‐functional tumor  suppressor gene. J. Cell. Sci 120, 3327‐3335(2007).   152. Brocardo, M. & Henderson, B.R. APC shuttling to the membrane, nucleus and beyond.  Trends Cell Biol 18, 587‐596(2008).   153. Caspi, M., Zilberberg, A., Eldar‐Finkelman, H. & Rosin‐Arbesfeld, R. Nuclear GSK‐3beta  inhibits  the  canonical  Wnt  signalling  pathway  in  a  beta‐catenin  phosphorylation‐ independent manner. Oncogene 27, 3546‐3555(2008).   154. Li,  Q.  et  al.  Daxx  cooperates  with  the  Axin/HIPK2/p53  complex  to  induce  cell  death.  Cancer Res 67, 66‐74(2007).   155. Rui,  H.  et  al.  SUMO‐1  modification  of  the  C‐terminal  KVEKVD  of  Axin  is  required  for  JNK  activation  but  has  no  effect  on  Wnt  signaling.  J.  Biol.  Chem  277,  42981‐ 42986(2002).   156. Maher, M.T. et al. Activity of the beta‐catenin phosphodestruction complex at cell‐cell  contacts is enhanced by cadherin‐based adhesion. J. Cell Biol 186, 219‐228(2009).  157. Lepourcelet,  M.  et  al.  Small‐molecule  antagonists  of  the  oncogenic  Tcf/beta‐catenin  protein complex. Cancer Cell 5, 91‐102(2004).   158. Chen,  B.  et  al.  Small  molecule‐mediated  disruption  of  Wnt‐dependent  signaling  in  tissue regeneration and cancer. Nat Chem Biol (2009).doi:10.1038/nchembio.137    159. Leung‐Toung,  R.  et  al.  Thiol  proteases:  inhibitors  and  potential  therapeutic  targets.  Curr. Med. Chem 13, 547‐581(2006).  160. Daviet,  L.  &  Colland,  F.  Targeting  ubiquitin  specific  proteases  for  drug  discovery.  Biochimie 90, 270‐283(2008).   161. Guo,  X.  et  al.  Axin  and  GSK3‐  control  Smad3  protein  stability  and  modulate  TGF‐  signaling. Genes Dev 22, 106‐120(2008).    

64   

Table 1:  Wnt pathway major components 

Drosophila  Porcupine (Porc)  Wntless (Wls)  Wingless (Wg)   

Human  Porcupine (Porc)  Wntless (Wls)  Wnt  Wnt  Inhibitory  Factor  (WIF‐ 1)    sFRP1    Dickkopf (Dkk)  Frizzled (Fz)  Frizzled (Fz)s  Arrow  Low  Density  Lipoprotein  Receptor‐Related  Protein  5  (LRP5/6)  Dishevelled (Dsh)  Dishevelled (Dvl/Dsh)  Adenomatous  Poliposis  Coli  Adenomatous  Poliposis  Coli  (APC)  (APC)  Axin  Axin  Zeste‐white 3 (Zw3)  Glycogen  Synthase  Kinase  (GSK3)    Casein Kinase 1 alpha (CK1α) Armadillo  β‐catenin (CTNNB1)    Norrin  Derailed  Ryk    Ror    T‐Cell Factor 4 (TCF4)    Groucho             

65   

Function  Wnt palmitoylation  Wnt secretion  Morphogen  Wnt antagonist  Wnt antagonist  LRP5/6 inhibitor  Wnt receptor  Wnt‐Fz coreceptor 

multipurpose  Scaffold protein, multipurpose  Scaffold protein  Kinase  Kinase  Transcription co‐activator  non‐Wnt ligand  Wnt receptor (RTK)  Wnt receptor (RTK)  Transcription factor  Transcription repressor   

Table 2.

A. Axin 1 Total

Unique

#n pulldowns

8312

88

47

4

9736

46

42

3

GSK3A glycogen synthase kinase 3 alpha

2931

14

11

4

GSK3B glycogen synthase kinase 3 beta

2932

14

9

4

APC adenomatous polyposis coli

324

8

8

4

CTNNB1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa

1499

7

7

1

PPP2R1A protein phosphatase 2, regulatory subunit A, alpha isoform

5518

8

6

3

WDR26 WD repeat domain 26

80232

7

6

3

CSNK1A1L casein kinase 1, alpha 1-like

122011

7

5

2

RANBP9 RAN binding protein 9

10048

4

4

3

RANBP10 RAN binding protein 10

57610

4

3

3

PPP2CA subunit, alpha isoform

5515

3

3

3

PPP2CB protein phosphatase 2, subunit, beta isoform

5516

3

3

3

YPEL5 yippee-like 5 (Drosophila)

51646

3

3

3

PPP2R5E protein phosphatase 2, regulatory subunit B', epsilon isoform

5529

2

2

3

Total

Unique

#n pulldowns

Protein

Gene ID

AXIN1 axin 1 USP34

specific

34

B. Axin 2 Protein

Gene ID

AXIN2 axin 2

8313

224

22

4

GSK3B glycogen synthase kinase 3 beta

2932

52

14

4

GSK3A glycogen synthase kinase 3 alpha

2931

48

13

4

APC adenomatous polyposis coli

324

43

22

4

CTNNB1 catenin (cadherin-associated protein), beta 1, 88kDa

1499

37

12

2

USP34

9736

23

14

3

3728

12

6

3

PPP2R1A protein phosphatase 2, regulatory subunit A, alpha isoform

5518

7

7

1

PPP2CA protein phosphatase 2, subunit, alpha isoform

5515

5

4

2

PPP2R5C protein phosphatase 2, regulatory subunit B', gamma isoform

5527

3

3

1

JUP

plakoglobin

66

Figure 1.

Destruction Complex APC PP2A

Axin

β-catenin P

P

P

CK1a

GSK3

P

Ub Ub RBX1

Ub

β-catenin Cul1

P

SKP1

P

P

Proteasome

P

β-TrCP

SCF β-TrCP complex

Figure 1. Regulation of β-catenin by the Destruction Complex. The Destruction Complex is a cytoplasmic protein complex responsible for the phosphorylation of free β-catenin, preparing it for ubiquitination by the SCFβ-TrCP complex and leading to its rapid degradation via the Proteasome. Axin acts as the main scaffold protein bringing CK1α and GSK3β into proximity to phosphorylate β-catenin. The presence of APC prevents PP2A from quickly dephosphorylating phospho-β-catenin, protecting it so it may reach the SCFβ-TrCP complex ubiquitin ligase complex. Within the SCF complex the Fbox protein β-TrCP acts as an E3 ligase specifically binding phospho-β-catenin. SKP1 is an adapter facilitating binding of β-TrCP to the Cul1 scaffold, which also carries the E2 conjugating enzyme RBX193. This assembly of proteins specifically binds and poly-ubiquitinates β-catenin, targeting it for destruction by the Proteasome.

67

Figure 2. Fz7

LRP6

Fz7

2

Wnt3a

LRP6

Extracellular

Dvl Dvl

Axin

P P P P

P P P P

P P P P

P

P

P

GSK3

Axin

APC PP2A

Axin

β-catenin P

P

P

CK1a

GSK3

Axin GSK3 GSK3

P

Cytoplasm

β-catenin

-TrCP SCF ββ-TrCP

β-catenin β-catenin

Proteasome

Nucleus

1 Groucho

TCF4

x

3 Groucho

β-catenin Dvl TCF4

Wnt target genes

Figure 2. Canonical Wnt Signalling. The diagram depicts the pathway in both inactive (left side) and activated (right side) states and the steps involved in initiation of signalling upon Wnt3a ligand binding: 1. When the pathway is quiescent, β-catenin is actively degraded. Within the nucleus, transcriptional repressor Groucho is bound to TCF4 and inhibits transcription of Wnt target genes. 2. Wnt3a activation of Fz7 and LRP6 leads recruitment of Dvl to the plasma membrane along with Axin-GSK3β. This brings GSK3β into proximity of LRP6 and leads to its activation by phosphorylation. Activated LRP6 promotes further Axin-GSK3β docking and attracts more LRP6 units, amplifying the signal. Recruitment of Axin away from the cytoplasm inhibits formation of the Destruction Complex, allowing β-catenin levels to increase. 3. No longer constitutively degraded, β-catenin can freely enter the nucleus and displace the repressor Groucho from TCF4. Along with Dvl, β-catenin helps condense other transcriptional co-activators and chromatin modifiers to unwind DNA and initiate transcription of Wnt target genes.

68

Figure 3.

DUBs Ub

mRNA

Ub

Ub

Ub

Ub

Ub

Ub

1 Ub

Ub

E1

2

Peptides Ub Ub

Proteasome

20S

E2

Ub

Ub

3

8

Ub Ub

DUBs

19S

Ub

DUBs substrate

substrate

7

E3

Ub Ub

Ub

Ub

4 Ub

Ub Ub

6

Ub

DUBs

5

substrate

DUBs

substrate

Degradation: K48 chains

Ub Ub

substrate Signaling/Localization: Mono-ubiquitin K63 chains

Figure 3. The Ubiquitin Cycle. The schematic describes the major aspects of Ubiquitin regulation within eukaryotes, including steps in which DUBs play a critical regulatory role: 1. Ubiquitin is always coded either as multimers or as fusion proteins, so one crucial role for DUBs is the cleave de-novo synthesized ubiquitins into monomers. 2. Free ubiquitin is unreactive and must be activated by E1 enzyme. 3. Activated ubiquitin is transferred from E1 to E2 conjugating enzymes, which can conjugate ubiquitin to proteins in close proximity when working in conjunction with E3 ligases. E3 ligases confer substrate specificity, presenting a high affinity β-TrCP ) substrate to the E2 for conjugation of ubiquitin. Typically E2 and E3 are found within the same protein complex (SCF 4. Following poly-ubiquitination, DUBs may operate in a chain editing capacity to ensure/modify a particular form of chain linkage (K48, K63, and perhaps other types). 5. DUBs may also rescue ubiquitinated proteins by completely removing ubiquitin. Following these modifications the proteins can proceed with their purpose, whether it is to signal or to localize in a particular subcellular compartment. 6. Substrates with four or more ubiquitin in K48 linked form are recognized by the proteasome and destroyed. 7. Ubiquitin conjugated to the substrate must be removed to facilitate substrate entry into the proteasome. The 19S regulatory particle (the proteasome “cap”) exhibits DUB activity for this process. Deubiquitinated proteins are then unfolded and enter the 20S catalytic particle of the proteasome for proteolysis into small peptides. 8. Free poly-ubiquitin chains (by-products of the proteasome) can be recycled by DUBs into monomers ready to begin the cycle anew.

69

Figure 4. GSK3B

A

GSK3A JUP

APC Axin2

WDR26

CTNNB1

USP34

RANBP9 RANBP10

PPP2R5C PPP2R1A

ARMC8

Axin1

PPP2CA

YPEL5

PPP2CB PPP2R5E CSNK1A1L

B

5% Input

Strep AP WB: α-USP34 (endogenous)

250kDa  WB: α-HA

130kDa  strep-HA-Axin1 strep-HA-Radil Lane

+ –

– +

+ –

– +

1

2

3

4

Figure 4. Iden of the n Specific Protease 34 (USP34) as an Axin interac g protein Wnt signalling and cells with intact Wnt Given the contradictory TOPFLASH results between colon cancer cells with defe signalling, we employed a targeted proteomic approach to study Axin: on network, arrows represen in ons found in Axin1 and Axin2 (red circles) A. Mammalian Axin1 & Axin2 protein i pull-down experiments using LC-MS/MS. Yellow circles are previously described associated proteins. on of the Axin-USP34 interac on using co-affinity puri on: In HEK293T cells, endogenous USP34 associates with B. Axin1 (lane 3) but not with the unrelated protein Radil (lane 4).

70

A

Figure 5.

Lysates WB: α-USP34 (endogenous)

B

WB: α-Lamin B

monoubiquitin



Lane 1

2

3

16

12

8

4

1.20

1

2

3

4

5 Radil complex

1.23

Axin1 (USP34 shRNA)

4.61

Axin1 complex

Lane

15.11 9.35

USP34 core

0 signal/ background:

isopeptidase reporter activity % of control protease

D

Ub

4 Axin1 complex (USP34 shRNA)

2

Axin1 complex

1

USP34 core

– +

USP2 core

Signal/Background

C

+ –

USP2 core

Non-targeting shRNA USP34 shRNA Lane

Sumo3 ISG15 Nedd8

100

75

50

25

0 Percent:

Control Protease USP34 core Lane

100 70.21

100 0.81

100 1.38

100 2.17

+ – – +

+ – – +

+ – – +

+ – – +

1

3

5

7

2

4

6

8

Figure 5. USP34 confers ubiquitin protease activity to the Axin protein complex. Characterization of USP34 enzymatic activity: A. Western blot verification of endogenous USP34 knockdown in HEK293T strep-HA-Axin1 cells stably expressing USP34 shRNA. Lamin B was used as loading control. B. Cleavage of K48-linked ubiquitin chains by recombinant USP2 and USP34 core domains and Axin1 protein complexes purified from HEK293T cells, but not from Axin1 protein complexes isolated from cells where USP34 expression was knockdown by shRNA. Cleavage is monitored with the appearance of mono-ubiquitin from the poly-ubiquitin chains. C. Quantification of relative ubiquitin protease activity using the Ubiquitin-PLA2 assay: Purified Axin1 complexes from HEK293T cells but not from cells expressing USP34 shRNA exhibited protease activity. Similar amount of the unrelated Radil protein complex showed no activity. Recombinant USP2 and USP34 were used as positive controls in this assay. D. Cleavage specificity of the USP34 core domains: Ub- Sumo3- ISG15- and Nedd8-PLA2 assays were used to demonstrate that the USP34 core domain preferentially cleaves ubiquitin.

71

Figure 6.

A

WB: α-USP34 (endogenous)

250kDa  35kDa  Control siRNA USP34 siRNA β-catenin siRNA Lane

B

WB: α-ERK

+ + – – – – – – – A B C D – – – – – – – + 1

2

3

4

5

6

7

HEK293T

RKO

30

TopFlash: Fold actiation over control

25 20 15 10 5 0 Fold activation:

Control CM Wnt3a CM Control siRNA β-catenin siRNA USP34 siRNA Lane

C

1.00

0.95

1.18 29.39 1.65

+ – + – –

+ – – + –

+ – – – +

– + + – –

1

2

3

4

5.93

1.00

1.18

– + – + –

– + – – +

+ – + – –

+ – – + –

+ – – – +

– + + – –

5

6

7

8

9

10 11 12

Control siRNA

0.84 28.46 6.66 10.93

– + – + –

– + – – +

USP34 siRNA WB: α-USP34 WB: α-β.Catenin

0

0.5

1

3

6

0

0.5

1

3

6

WB: α-Lamin B Wnt3a CM (hours)

Figure 6. USP34 has a positive regulatory function in Wnt signalling. Since USP34 may be modulating Axin ubiquitination status, we explored its functional role in signalling using the TOPFLASH assay, and conducted a variety of experiments establishing where USP34 may function within the pathway activation sequence: A. Validation of USP34 siRNAs: TOPFLASH assay in RKO cells treated with 4 independent siRNA targeting USP34. Lysates were then analyzed by western blot using anti-USP34 antibodies to monitor knockdown efficiency and anti-ERK antibodies as loading control. USP34 siRNA ‘A’ was used for subsequent experiments. B. TOPFLASH assays in HEK293T and RKO cells treated with control siRNA (lanes 1,4,7,10) β-catenin siRNA (lanes 2,5,8,11) or USP34 siRNA (lanes 3,6,9,12), then stimulated with control conditioned media (lanes 1,2,3,7,8,9) or Wnt3A conditioned media (Lanes 4,5,6,10,11,12). USP34 knockdown inhibited Wnt3A mediated activation of the TOPFLASH reporter in both cell lines (lane 4 vs. 6, lane 10 vs. 12). C. USP34 knockdown does not influence Wnt3A-induced stabilization of β-catenin. RKO cells treated with control or USP34 siRNA were stimulated with Wnt3A conditioned media for the indicated duration and lysates probed for β-catenin levels by western blot.

72

D

E

40 35 30 25 20 15 10 5 0

Fold activation:

Control Plasmid 400ng pt.β-catenin 400ng Control siRNA β-catenin siRNA USP34 siRNA Lane

HCT116

SW480

100 48.66 2.46

100 29.05 7.08

140

TopFlash: Percent of Control siRNA

TopFlash: Fold actiation over control siRNA

Figure 6.

1.00

31.19

4.04

19.71

+ – + – –

– + + – –

– + – + –

– + – – +

1

2

3

4

QPCR: Percentage change versus control siRNA

F

100 80 60 40 20 0 Percent:

Control siRNA USP34 siRNA β-catenin siRNA Lane

Nkd1

120

120

+ – – + – – – + – – + – – – + – – + 1

2

3

4

5

6

Tnfsrf19

100 80 60 40 20 0 Percent:

Naked (Nkd1) Troy (Tnfsrf19) Control siRNA USP34 siRNA β-catenin siRNA Lane

100 62.10 19.06 100 43.95 29.16

+ – + – –

+ – – + –

+ – – – +

– + + – –

– + – + –

– + – – +

1

2

3

4

5

6

Figure 6. USP34 has a positive regulatory function in Wnt signalling. Results from C,D, and E suggest USP34 is acting downstream of Destruction Complex, likely at the level of nuclear gene transcription: D. Epistasis analysis of USP34 function: TOPFLASH assays in HEK293T cells showed that USP34 and β-catenin but not control siRNA antagonized the activation of the pathway by overexpression of the stabilized β-catenin mutant (lanes 2,3 and 4). E. TOPFLASH assays in HCT116 and SW480 cells treated with USP34 siRNA showed that the aberrant activation of the β-catenin reporter in these cells requires USP34 function (lane 1 vs. 2, lane 4 vs. 5). F. Quantitative RT-PCR analysis of SW480 cells treated with USP34 siRNA show reduced expression of the Wnt target genes Naked (NKD1) and Troy (Tnfsrf19) as a percentage of control siRNA, similar in effect to β-catenin siRNA knockdown. Gene expression normalized to cyclophilin.

73

Figure 7.

A

HCT116

B

SW480

TopFlash: Fold activation over Control

TopFlash: Percent of Control siRNA

120 100 80 60 40 20 0

Control siRNA Axin 1+2 siRNA β-catenin siRNA Lane

RKO

80

140

Percent:

HEK293T

60

40

20

0

Fold activation:

100 64.47 10.84 100 30.44 7.08

+ – – + – – – + – – + – – – + – – + 1

2

3

4

5

Wnt3a CM Control siRNA Axin 1+2 siRNA Lane

6

1.00 29.39 72.30 1.00 25.61 66.18

– + + – + + + + – + + – – – + – – + 1

2

3

4

5

6

Figure 7. Uncovering a positive regulatory role for Axin in pathological Wnt signalling. We examined Wnt pathway activity using TOPFLASH assay in HCT116 and SW480 colon cancer cells that exhibit aberrant Wnt signalling, then in HEK293T and RKO, two cell lines with intact Wnt pathway: A. Constitutively active Wnt signalling in HCT116 and SW480 colon cancer cells (lanes 1, 4) can be reduced by siRNA mediated knockdown of Axin1/2 (lanes 2, 5), β-catenin siRNA included as positive control (lanes 3, 6). B. Axin1/2 knockdown potentiates Wnt response in HEK293T and RKO cells with intact Wnt pathway when stimulated by Wnt3A (lane 2 vs. 3, 5 vs. 6). Axin1/2 knockdown alone without Wnt3A stimulation does not change response vs. control (not shown). TOPFLASH assay figures are representative of at least three independent experiments performed in duplicates where the error bars represent the standard errors.

74

Figure 7.

D

25

Control siRNA

Axin 1 siRNA

20

SW480

TopFlash: Fold activation over Control

C

15 10 5

Control Plasmid 400ng pt.β-catenin 400ng Control siRNA β-catenin siRNA Axin 1+2 siRNA Lane

1.00 15.98 1.58

6.30

+ – + – –

– + + – –

– + – + –

– + – – +

1

2

3

4

HCT116

0 Fold activation:

Figure 7. Uncovering a positive regulatory role for Axin in pathological Wnt signalling. We examined Wnt pathway activity using TOPFLASH assay in HCT116 and SW480 colon cancer cells that exhibit aberrant Wnt signalling, then in HEK293T and RKO, two cell lines with intact Wnt pathway: C. Epistatic activation of the Wnt pathway in HEK293T cells expressing degradation resistant β-catenin mutant (pt.mutant.βcatenin; mimics HCT116) is also inhibited by Axin1+2 knockdown, suggesting that Axin1/2 is necessary for maximal pathway activation. D. Immunofluorescence using polyclonal anti-Axin1 antibodies: Axin localizes to the nucleus of colon cancer cells (left panels). Specificity of the antibody was controlled using Axin1 siRNA (right panels). TOPFLASH assay figures are representative of at least three independent experiments performed in duplicates where the error bars represent the standard errors.

75

Figure 8. Control siRNA

USP34 siRNA

Axin1 siRNA

HCT116

SW480

A

B no LMB

Control siRNA

5ng/mL LMB

Control siRNA

USP34 siRNA

Axin1 siRNA

Figure 8. USP34 controls the nuclear-cytoplasmic shuttling of Axin. The strong nuclear localization of Axin in colon cancer cells (Fig.7D), attenuation of aberrant signalling upon Axin/USP34 knockdown, and epistasis data showing USP34 function at the transcription level all suggested that USP34 may be maintaining Axin function which in turn modulated signalling. Using immunofluorescence microscopy we found USP34 knockdown altered Axin localization: A. USP34 knockdown (middle panels) inhibits the strong nuclear localization of Axin seen in SW480 and HCT116 colon cancer cells transfected with control siRNA (left panels). B. USP34 depletion (middle panel) also inhibits the nuclear accumulation of Axin in HEK293 cells observed when the CRM1 dependent nuclear export is blocked with Leptomycin B (left panel). In each experiment the specificity of the Axin antibody was controlled using Axin1 siRNA (right panels).

76

Figure 9.

A 250kDa  AP: Strep (Axin) WB: α-Flag (Ubiquitin)

130kDa  90kDa  72kDa 

250kDa  Lysates WB: α-HA (Axin)

130kDa  90kDa  72kDa 

NEM Lane

– 1

+ 2

Figure 9. Ubiquitinated Axin is sensitive to ubiquitin specific protease activity (USP). Because USP34 exhibited ubiquitin protease activity and was associated with Axin, we hypothesized and found that Axin is ubiquitinated (and hence a target for USP34): A. Cells stably expressing Strep-HA-Axin1 were transfected with Flag-Ubiquitin. Input lysates prepared for streptavidin affinity purification were left untreated (lane 1) or treated with the non-specific USP inhibitor NEM (lane 2). Ubiquitin-linked Axin were resolved by SDS-PAGE and detected using anti-FLAG antibodies (top panel). The purification of Axin was controlled using anti-HA antibodies (bottom panel). The inhibition of USP activity robustly increase the amount of ubiquitinated Axin detected (compare lane 2 vs. 1).

77

Figure 10.

A

MG132 (1uM 24h)

USP34 siRNA

Control siRNA

DMSO ccontrol

B

WB: α-Axin (endogenous) WB: α-Lamin B

Control siRNA USP34 siRNA MG132 (1uM) Lane

+ – –

– + –

+ – +

– + +

1

2

3

4

C

WB: α-Axin (endogenous) WB: α-Lamin B

P5075 (uM) 2h Lane

0 1

1 2

2 3

5 4

10 5

20 6

Figure 10. USP34 knockdown destabilizes Axin. Recently we acquired a very clean antibody specific for Axin1 which allowed us to measure endogenous Axin protein levels directly, providing a new tool to elucidate the effect of USP34 loss on Axin: A. Immunofluorescence images of SW480 colon cancer cells: USP34 knockdown induced loss of nuclear Axin, which can be rescued by the proteasome inhibitor MG132. B. Western blot on SW480 lysate demonstrating significant reduction of Axin upon USP34 knockdown, also rescued by MG132. C. Dose-dependent Axin destabilization upon inhibition of DUBs by the general cysteine-protease inhibitor P5075 after 2h treatment in SW480 colon cancer cells.

78

List of Abbreviations  APC  BCL9  β‐TrCP  CK1α  CK2  CRD  Cul1  Dkk  DUB  DVL  ECM  ER  FAP  Fz  GSK3β  HECT  HSC  HSPG  JNK2  LC‐MS/MS  LEF  LMB  LRP6  MEKK1  MJD  NLS  NSCLC  OTU  PCNA  PCP  PORC  PP2A  RING  RTK  SFRP  siRNA  TCF4 

Adenomatous Polyposis Coli B‐cell Lymphoma 9 β‐Transducin repeat‐Containing Protein Casein Kinase 1α  Casein Kinase II  Cysteine Rich Domain Cullin  Dickkopf  Deubiquitinating Enzyme Dishevelled  Extracellular Matrix Endoplasmic Reticulum Familial Adenomatous Polyposis Frizzled Receptor Glycogen Synthase Kinase 3β Homologous to E6AP Carboxy Terminus Hematopoietic Stem Cells Heparin Sulfate Proteoglycan c‐Jun N‐terminal Kinase 2 Liquid Chromatography‐Tandem Mass Spectrometry Lymphoid Enhancer‐binding Factor Leptomycin B  Low density lipoprotein Receptor‐related Protein 6 Mitogen‐activated protein kinase kinase kinase 1 Machado‐Joseph Disease Protein Domain Proteases Nuclear Localization Sequences Non‐Small‐Cell Lung Cancer Ovarian Tumor Proteases Proliferating Cell Nuclear Antigen Planar Cell Polarity Porcupine Acyltransferase Protein Phosphatase 2A Really Interesting New Gene Receptor Tyrosine Kinase Soluble Frizzled‐Related Protein Small interfering RNA T‐Cell Factor 4  79 

 

TGN  U‐box  UCH  UPS  USP  WG  WIF  Wls   

Trans‐Golgi‐Network UFD2 homology  Ubiquitin C‐terminal Hydrolases Ubiquitin‐Proteasome System Ubiquitin Specific Proteases Wingless  Wnt Inhibitory Factor Wntless 

 

80